Некультивируемые формы бактерий

ФГБОУ ВПО “Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А. “

Кафедра “Экология”

Курсовая работа

по предмету экология организмов

на тему:

“Некультивируемые формы бактерий”

Выполнила:

студентка группы ЭКЛ-31

Азизова М.Н.

Проверила:

Абросимова О.В.

Саратов 2012

Содержание

• Введение
• 1. Что такое некультивируемые формы
• 2. Методы выявления НФ
• 3. Преимущества метода ПЦР (полимеразная цепная реакция)
• 4. Индукторы НС
• 5. Индукторы реверсии НФ
• Заключение
• Список литературы

Введение

Некультивируемыми (НФ) называют такие формы микроорганизмов, которые в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшений условий культивирования возобновляют пролиферацию. Некультивируемое состояние (НС) обнаружено у многих патогенных видов. В связи с тем, что рутинные бактериологические методы не эффективны для обнаружения НФ, истинные размеры распространения феномена в объектах окружающей среды остаются мало изученными. С целью решения вопроса о значении феномена в эпидемиологии интенсивно изучаются индукторы НС и реверсии.

В настоящее время известно около 45 видов микроорганизмов, относящихся к 30 родам, у которых обнаружено НС.30 видов патогенны для человека, 15 видов условно-патогенны или являются эубионтами человека, животных или растений. Среди бактерий, у которых обнаружено НС, есть возбудители таких грозных инфекций, как чума, холера, тулерямии, легионеллез. Более 60% видов, образующих НФ, грамотрицательны. Около 40% составляют бактерии, относящиеся к трем другим отделам царства Procariotae: грамположительные бактерии, микоплазмы и архебактерии. Эти факты указывают на универсальность некультивируемого состояния как общебиологического явления, расширяют первоначально сложившееся представление о спороподобном состоянии НФ и наглядно демонстрируют широкое распространение феномена в природе [1].

1. Что такое некультивируемые формы

Речь идет не о всех микроорганизмах, а только о прокариотах – бактериях и археях. Со времен Луи Пастера основной способ изучения бактерий – это выделение их в чистую культуру на искусственную питательную среду. Исследуемый материал распределяется по поверхности среды, присутствующие в нем отдельные микробные клетки начинают размножаться и образуют визуально различимые колонии. Вот с этими колониями и начинают работать.

Однако недавно было обнаружено, что многие другие виды бактерий также способны переходить в покоящееся состояние под действием неблагоприятных условий (голодание, пониженная или повышенная температура и т.д.). Эти формы характеризуются морфологическими изменениями, низким уровнем метаболизма, утратой способности к размножению Они не выявляются при высевах на питательные среды (поэтому были названы НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫМИ ФОРМАМИ), однако могут быть переведены в “культивируемое” состояние при изменении условий, при попадании в организм основного или промежуточного хозяина (для болезнетворных), или с помощью специальных индукторов. Выяснилось, что именно “некультивируемые формы” ответственны за неожиданные вспышки некоторых инфекций (например – холеры, чумы), когда между эпидемиями возбудитель никуда не девается, хотя и не выявляется стандартными микробиологическими анализами.

Основная проблема при выделении бактерий – это подбор соответствующей питательной среды и условий культивирования, поскольку если среда и/или условия не подходят для данной бактерии – она просто не образует колонию и не будет учтена. Таким образом, наши представления о биоразнообразии бактерий фактически зависят от того, насколько удачно подобраны среды для их выделения и условия культивирования.

некультивируемая форма бактерия питательный

А надо заметить, что требования различных видов к питательной среде и условиям очень сильно различаются – по мере развития микробиологии это становилось все очевиднее. Например, какая-нибудь почвенная Bacillus прекрасно растет на питательных средах самого разного состава – от мясного отвара до синтетической среды с глюкозой и минеральными элементами, а некоторые паразитические или симбиотические виды требуют точно сбалансированных количеств разнообразных аминокислот, пуринов, витаминов, углеводов и т.д. А какие-нибудь водные олиготрофы вообще гибнут на богатых средах из-за субстратного ингибирования.

Тем не менее, к концу 70-х в микробиологии господствовало мнение, что о видовом разнообразии бактерий, по крайней мере в “основных” местах обитания (вода, почва, организм человека и животных, растения), известно если не все, то почти все. За 100 лет все мыслимые питательные среды подобраны, опубликованы в учебниках и методичках, все виды прилежно описаны и включены в определители. Открытие каждого нового вида было достаточно большим событием.

Правда, было показано, что методы прямого счета (с использованием микроскопа) дают общую численность бактерий в почве и в воде как минимум на 2-3 порядка (!) больше, чем обнаруживается при высеве на стандартные питательные среды. “Нестыковку” объясняли 1) недостаточным диспергированием исследуемого материала, когда группа бактериальных клеток дает на питательной среде одну общую колонию, и, таким образом, учитывается как одна клетка;

2) наличием в популяции большого числа мертвых клеток, которые под микроскопом (без спец. методов окраски) неотличимы от живых, но колоний на питательной среде, естественно, не образуют.

Однако в 1983 г произошло революционное событие – открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР, в англоязычной литературе – PCR). Методы диагностики, использующие ПЦР, позволили обнаруживать и идентифицировать фрагменты бактериальной ДНК непосредственно в окружающей среде, даже если они присутствуют там в минорных количествах.

И очень быстро обнаружилось, что огромное количество (в некоторых случаях – до 90-99%) ДНК-последовательностей, выявляемых в окружающей среде, не может быть отнесено ни к одному из известных видов бактерий или архей. Т.е. из “плавающих” в окружающей среде последовательностей только 1-10% принадлежат известным видам, а остальные – неизвестно никому. Эти “неизвестно кто” и были названы “некультивируемыми видами” (не путать с некультивируемыми формами).

Литература, особенно англоязычная, сейчас пестрит сообщениями о некультивируемых видах (Google, например, на запрос “non-cultivated” microorganisms сходу выдал 996 документов). Их находят везде – от воды, почвы, организма человека и животных до “экзотических” мест обитания (глубоководные вулканические источники и т.д.). Причем в целом ряде случаев не удается обнаружить полных аналогов в имеющихся генетических базах данных, в связи с чем появляются формулировки типа “Обнаруженные бактерии наиболее близки к цианобактериям, однако, без существенного сходства”.

Пока эти микроорганизмы не выделены в чистые культуры на искусственные питательные среды, главное, что о них можно сказать – это что они ЕСТЬ, и по крайней мере часть из них не может быть отнесена ни к одной из известных групп бактерий или архей.

Удастся ли их выделить в чистые культуры и изучить? Видимо, со временем подходящие среды и условия культивирования будут подобраны. Главное, что стало ясно, что среды и методы культивирования, использовавшиеся до сих пор, дают, мягко говоря очень неполное представление о реальных микробных сообществах, и надо продолжать подбирать новые среды/методики.

Каков процент “некультивируемых” среди общего числа прокариот? Никто не знает, оценки варьируют в основном от 90 до 99,9%.

Систематика прокариот разработана слабо. До недавнего времени “наивысшим таксоном” был род, иногда их объединяли в семейства. Все попытки выделить таксоны более высокого ранга отражали в основном не реальную эволюционную близость, а текущий уровень развития микробиологических методов и личные предпочтения авторов. Достаточно сказать, что Археи в качестве самостоятельной эволюционной ветви выделили только в конце 70-х – начале 80-х, а до этого относили к бактериям [2].

2. Методы выявления НФ

Для выявления НФ в организме или клиническом материале наиболее широко используются молекулярно-генетические методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее различные модификации, лигазная цепная реакция (ЛЦР), техника гибридизации тотальной клеточной РНК, ПЦР с обратной транскриптазой. Преимущество указанных методов является их высокая чувствительность и специфичность. Белки-шапероны, которые связываются с ДНК в процессе перехода в НС, могут препятствовать выявлению НФ в ПЦР.

В водных объектах окружающей среды НФ можно обнаружить с помощью флуоресцирующих моноклональных антител (МКА), что позволяет определить видовую принадлежность бактерий, но неинформативно в отношении жизнеспособности клеток. Применение магнитных сорбентов повышает чувствительность метода, а использование набора специфических моноклональных антител к стабильным и лабильным эпитопам липополисахарида дает возможность судить о потенциальной жизнеспособности НФ. Перечисленные методы позволили выявить присутствие НФ патогенных бактерий в организме человека и животных в продуктах питания, в объектах окружающей среды: в воде в почве. Экспериментальные и гипотетические сведения об обнаружении НФ в

окружающей среде дополняют работы об индукторах НС и реверсии [3].

3. Преимущества метода ПЦР (полимеразная цепная реакция)

Среди всех методов выявления НФ бактерий, разработанных к настоящему времени, особо выделяется группа молекулярно-генетических методов, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью. Молекулярно-генетический метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является наиболее адекватным для обнаружения НФ бактерий в объектах окружающей среды. Возможность совершенствования и развития различных модификаций ПЦР позволяет решать большой спектр научных и прикладных задач, связанных с НФ бактерий. “Классический” вариант ПЦР подразумевает качественный ответ на вопрос о наличии в исследуемом образце ДНК выявляемого микроорганизма. Это существенно ограничивает его использование. Создание количественного варианта ПЦР позволило бы значительно расширить возможности исследования абиотических факторов, приводящих к образованию НФ, молекулярно-генетических основ этого процесса, а также решения ряда научно-прикладных задач, например, при проведении микробиологического мониторинга за возбудителями в окружающей среде и при лечении инфекционных заболеваний человека. Поэтому задача разработки молекулярно-генетических методов, обладающих всеми достоинствами ПЦР (чувствительностью, специфичностью и универсальностью) и сочетающих в себе количественный анализ, особенно актуальный при детекции НФ бактерий в окружающей среде и контроле возбудителя при лечении инфекционных заболеваний, является актуальной.

Впервые предложен методический подход на основе последовательных реакций обратной транскрипции и разработанного количественного варианта ПЦР для выявления и доказательства жизнеспособности бактерий в НС. Метод исключает возможность индикации нежизнеспособных, мертвых клеток, содержащих неразрушенный генетический материал, так как маркером присутствия и жизнеспособности бактерий в этом случае является короткоживущая специфическая молекула мРНК заведомо экспрессирующегося в НФ и известного исследователю гена. На модельном эксперименте с Salmonella typhimurium показано, что указанный метод можно рекомендовать для выявления жизнеспособных НФ различных бактерий в окружающей среде.

Практическая значимость: Разработаны два варианта количественной анализа результатов полимеразной цепной реакции, основанные на иммобилизации ПЦР-продуктов на твердом носителе с последующим количественным определением иммобилизованного материала и включающие следующие этапы:

1) введение молекулярной метки в амплифицированный фрагмент;

2) специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси;

3) количественную детекцию метки. Методы характеризуются разным решением этапов анализа и могут быть использованы для выявления бактерий в образцах различной природы, в том числе и в клинической диагностике. В данной работе методы применены для выявления НФ и количественной оценки числа бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella typhimurium в субстратах внешней среды. В сочетании с бактериологическим методом они позволяют дифференцировать НФ возбудителей и количественно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах. [4]

4. Индукторы НС

При создании экспериментальных систем, получивших название микрокосмов, моделируются факторы естественной среды обитания (температура, вода различного состава и солености, аэрация, видимый свет). Высказано предположение, что температура +0,5-+7оС является основным фактором, индуцирующим образование НФ, как это было показано для Campylobacter jejuni, V. cholerae [4]. Переход в НС зависит не только от температуры культивирования, но и от вида микроорганизма, его физиологического состояния, сопутствующих факторов. V. cholerae eltor переходили в НС при благоприятной температуре (25оС), но в присутствии высокой концентрацией солей.

Даже незначительные вариации химического состава среды при оптимальной температуре могут индуцировать переход в НС. Так, например, при сравнении двух образцов питьевой воды, один из которых индуцировал образование НФ Agrobacterium tumefaciens и Rhizobium meliloti, было обнаружено, что образцы совпадали по 39 химическим элементам и отличались только содержанием меди. В пробе, которая положительно влияла на образование НФ, концентрация меди была в несколько раз выше.

Среди химических индукторов НС в отдельную группу следует выделить антибиотики, так как эти сведения имеют практическое значение. В модельных экспериментах in vivo показан переход в НФ E. coli в присутствии ципрофлоксацина M. tuberculosis – рифализила в комбинации с изониазидом. Пролиферация может быть обратимо утрачена под влиянием концентраций хлора, применяемых для обеззараживания воды, в связи с чем предлагается пересмотреть бактериологические критерии оценки качества питьевой воды [5].

Приведенные сведения указывают на необходимость коррекции традиционных схем антибиотикотерапии с учетом новых знаний об индукции НС, на необходимость проведения лечения под контролем молекулярно-генетических методов диагностики. Решению этой задачи способствует выявление общих и видоспецифических маркеров НС. Получены первые обнадеживающие результаты в этом направлении. Протеомный анализ E. faecalis в НС, вегетативных клеток, и клеток, находящихся в состоянии стресса (старвирующих) показал существенное отличие их белковых профилей. Обнаружена значительная экспрессия двух стрессовых белков с высокой молекулярной массой. Экспрессия генов фруктозо-дифосфат альдолазы и EF-Ts наблюдалась через 14 суток НС, РНК EF-Tu присутствовала только в переходных популяциях, ген pdp5 обнаруживался в течение трех месяцев НС и был использован в качестве положительного контроля. Приведенные данные подтверждают наличие специфических маркеров НС, которые могут использоваться для разработки диагностических тестов [6].

Не менее значимыми, чем химические, являются физические факторы индукции НС. Сообщается о влиянии g-лучей аэрации кратковременного воздействия солнечной радиации в естественных условиях и в экспериментальных микрокосмах. Чередование световой и темновой фазы индуцировало переход в НС S. typhimurium.

Долгое время биологические индукторы НС оставались не известны. Но появились немногочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о важной роли биотических факторов в образовании НФ. L. monocytogenes в ассоциации с зелеными водорослями или в присутствии их экзометаболитов значительно быстрее переходили в НС, чем в контроле. Сине-зеленые водоросли и их экзометаболиты ускоряли образование НФ Y. pseudotuberculosis. В экспериментах живые клетки Scenedesmus quadricauda и их экзометаболитов инициировали образование НФ V. cholerae O1 и O139. Разрушенные зеленые водоросли, культура Spirulina platensis, напротив, продлевали вегетативную фазу холерных вибрионов. Экспериментальное получение НФ бактерий в микрокосмах, содержащие биотические компоненты, подтверждает гипотезу о возможности сохранения различных возбудителей в объектах окружающей среды, в том числе, в ассоциации с фито – и зообионтами.

Поиск индукторов НС ведется параллельно с поиском стимуляторов реверсии, так как именно восстановление культивируемости является бесспорным доказательством жизнеспособности НФ [7].

5. Индукторы реверсии НФ

Накоплен экспериментальный материал, демонстрирующий способность НФ возобновлять рост в благоприятных условиях. Условия реверсии включают использование различных индукторов реверсии (физических, химических, биотических), но могут заключаться и только в отмене неблагоприятных воздействий, как, например, показано для микроорганизмов, подвергнутых воздействию гамма-лучей.

Среди физических факторов наиболее часто к реверсии приводит повышение температуры с 0,5-6оС до 20-22о С или до 37оС, кратковременный прогрев до 45оС. Быстрое увеличение КОЕ в микрокосмах рассматривается как подтверждение реверсии, а не возобновление роста нескольких выживших клеток.

В ряде случаев оптимизацией температуры не удается стимулировать реверсию. V. parahaemolyticus реверсирует при повышении температуры до 25оС в сочетании с использованием минимальной солевой среды. НФ V. harveyi and V. fischeri возобновляют рост при добавлении органических или неорганических источников азота, углерода или деструкторов перекиси водорода.

Среди химических индукторов реверсии НФ известна группа соединений, разрушающих перекись водорода (антиоксиданты). К таким соединениям относят пируват натрия, каталазу, витамин Е. Их вводят непосредственно в микрокосмы в качестве протекторов или в состав питательных сред, предназначенных для реверсии. Это позволило получить реверсию E. coli, V. parahaemolyticus. На эффективность реверсии влияет химический состав среды и ее агрегатное состояние (предпочтительнее жидкие питательные среды).

Для реверсии НФ в питательные среды добавляют ростовые биотические факторы: фетальную сыворотку, супернатант растущей культуры или выделенный из нее рекомбинантный белок Rpf. Сообщается о влиянии цитокинов на реверсию НФ. Некультивируемые вирулентные штаммы сальмонелл реверсировали in vitro и in vivo в присутствии фактора некроза опухоли (ФНО) [8].

Иногда единственно эффективный способ реверсии – это пассаж через восприимчивый организм. Так, например, рекультивация НФ патогенных штаммов сальмонелл при введении в организм чувствительных животных всегда приводила к положительному результату. Параллельная рекультивация тех же суспензий in vitro не давала положительных результатов [9].

Истинность реверсии, а не возобновление роста выживших клеток, остается наиболее дискуссионным вопросом. В качестве доказательства реверсии используют рост из небольшого инокулюма. Рост культуры из маленького количества у вегетативных клеток происходит гораздо медленнее, чем в вариантах с НФ [10].

Клеточные структуры точно не изучались, поскольку сами клетки не культивировались, а известны исключительно по фрагментам ДНК. Видимо, все-таки придется выделять “некультивируемых” в чистые культуры. Однако для этого нужны дешевые, быстрые и доступные любой лаборатории методы генетического анализа. Тогда, например, обнаружив в образце ДНК “некультивируемых”, можно начать подбирать среды и условия, каждый раз проверяя генетическими методами: выросшая колония – это искомый “некультивируемый микроорганизм”, или нет? Если нет – опять варьировать среды и условия, пока, наконец “некультивируемый” не станет культивироваться. Другой возможный способ “взглянуть им в лицо” – это попробовать посадить на выделенную “некультивируемую” ДНК какую-нибудь флуоресцентную или радиоактивную метку, запустить в природу и посмотреть, с кем она сгибридизируется по принципу комплиментарности. Что же касается организации ДНК – в основном для диагностики используют не всю ДНК, а только участок, кодирующий 16S рибосомальную РНК, и здесь каких либо принципиальных отличий между бактериями, археями и “некультивируемыми”, нет. 16S РНК выбрана по ряду вполне биологически обоснованных причин. Но такой подход еще и “от бедности”: анализировать целую ДНК очень накладно и трудоемко, полное секвенирование генома выполнено для очень немногих прокариот (вспомните, сколько сил и лабораторий по всему миру было задействовано на геном человека, а ведь у бактерии всего в 10 раз меньше генов, чем у нас) [11].

Заключение

Феномен существования жизнеспособных бактерий в НС имеет серьезное значение в инфекционной патологии людей и животных, так как установлено, что некультивируемые формы (НФ) патогенных бактерий сохраняют свои вирулентные свойства. Эндемичность многих природноочаговых сапронозных инфекций и сохранение их возбудителей в межэпидемические периоды могут быть связаны со способностью этих возбудителей образовывать НФ. Процесс развития и совершенствования методологии выявления НФ бактерий тесно взаимосвязан с процессом познания и изучения свойств НФ бактерий, механизмов перехода бактерий в НС и их рекультивации, роли НФ в инфекционной патологии людей и животных.

К образованию НФ могут приводить разнообразные воздействия, как биотические, так и абиотические. Огромное влияние имеют факторы окружающей среды: температура, солнечная радиация, химический состав воды, наличие фито – и зообионтов. Характер и интенсивность этих воздействий определяют возможность реверсии НФ. Среди индукторов НС практически все абиотические факторы являются источниками свободных радикалов, которые обладают цитотоксическим действием. Вероятно, этим объясняется положительное действие антиоксидантов на возобновление деления. Иногда для реверсии требуется не только отмена неблагоприятного воздействия и добавление нейтрализаторов свободных радикалов, но и использование специфических индукторов реверсии: цитокинов, ростовых факторов. Одной из причин реверсии НФ бактерий в макроорганизме также могут быть антиоксидантные свойства его ферментов и наличие цитокинов. Но биотические индукторы реверсии имеют множественный характер стимуляции. Широкое распространение НФ в природе, способность патогенных и условно-патогенных бактерий переходить в НС, индукция НФ антибиотиками обусловливают социально-экономическое и санитарно-гигиеническое значение некультивируемых бактерий [13].

Список литературы

1. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Диденко Л.В. и др. Журн. // Mикробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. №5. C.9-13.

2. Литвин В.Ю. // Механизм устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы). Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. №4. C.26-31.

3. Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Пичурина Н.Л. и др. // Некультивируемые формы Francisella tularensis. Журн. Микробиол. 2000. №2. С.11-15.

4. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Цитокины // Возможные активаторы роста патогенных бактерий. Вестник РАМН. 2000. №1. C.3-18.

5. Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л. // Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса. Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1998. №3. C.3-8.

6. Соколенко А.В. // Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов. Автореф. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону. 2000. №7. C.21-29.

7. Соколенко А.В., Алексеева Л.П., Ломов Ю.М., Чемисова О.С. // Изучение взаимодействия некультивируемых форм холерных вибрионов с моноклональными антителами к липополисахариду О1 и О1 серогрупп. Биотехнология. 2004. №3. C.87-92.

8. Солохина Л.В., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. // Образование покоящихся форм и изменчивость Yersinia pseudotuberculosis под воздействием сине-зеленых водорослей (цианобактерий) и их экзометаболитов. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. №3. C.17-22.

9. Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко Е.Н. // О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся (некультивируемой) форме. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. №4. C.42-46.

10. Тафельштейн Э.А., Голубинский Е.П., Марамович А. С,. и др. // Экспериментальное получение некультивируемых форм Vibrio cholerae eltor и характеристика их биологических свойств. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. №1. C.13-18.

11. Титова С.В., Соколенко А.В., Николеишвили Л.Р. и др. // Образование некультивируемых форм холерных вибрионов при совместном культивировании с одноклеточными водорослями и продуктами их жизнедеятельности. Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии. Ростов-на-Дону. 2004. № 17. C.37-41.

12. Четина Е.В. // Влияние некоторых физиологических и генетических факторов на процесс перехода энетротоксигенных штаммов Escherichia coli в некультивируемое состояние. Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1997. №1. C.8-14.

13. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В. и др. // Образование “некультивируемых” клеток Micobacterium tuberculosis и их оживление. Микробиология. 2003. T.72 (1). C.76-83.