Контаминация микотоксинами продукции и определение афлатоксинов в пшенице

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Самарская государственная сельскохозяйственная академия»

Кафедра «Технология производства продуктов животноводства»

Курсовая работа

по дисциплине: «Экологическая экспертиза продуктов и сырья»

Тема: «Контаминация микотоксинами продукции и определение афлатоксинов в пшенице»

Выполнил: студент 4 курса

Кривошеева Марина Михайловна

Самара 2015

Реферат

Курсовая работа представлена пояснительной запиской. Пояснительная записка содержит 32 страницы машинописного текста, включает 13 наименований использованных источников.

Ключевые слова: микотоксины, афлатоксины, ПШЕНИЦА, исследование, МЕТОДЫ, проба, результат.

Объектом исследований является пшеница.

В работе изучены вопросы практической организации проведения определения афлатоксинов в пшенице для развития производства качественных и безопасных продуктов питания, раскрыта актуальность оценки продукции на содержание микотоксинов в том числе афлатоксина. Описана классификация и дана характеристика методов определения афлатоксинов в пшенице. Рассмотрен способ определения афлатоксина в пшенице методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Оглавление

• Реферат
• Введение
• 1. Обзор литературы
• 2. Специальная часть
• 2.1 Этапы оценки продукции с целью обнаружения микотоксинов, в том числе афлатоксинов
• 2.2 Методы определения микотоксинов
• 2.3 Определение афлатоксинов в пшенице методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
• Заключение
• Список использованной литературы и источников

Введение

Проблема качества и безопасности пищи всегда была одной из самых важных проблем, стоящих перед человеческим обществом. Все кроме кислорода человек, получает для своей жизнедеятельности из пищи. Среднее потребление ее в сутки составляет около 800 г (без воды) и около 2000 г воды.

Правильная организация питания требует знания, хотя бы в самом общем виде, химического состава пищевого сырья и готовых продуктов питания, представлений о способах их получения, о превращениях, которые происходят при их получении и при кулинарной обработке продуктов питания.

Все пищевые вещества полезны здоровому организму в оптимальных количествах и оптимальном соотношении. Но в пище всегда имеются микрокомпоненты, которые в относительно повышенных количествах вызывают неблагоприятный эффект. К ним относят, во-первых, так называемые токсиканты — натуральные, присущие данному виду продукта биологически активные вещества, которые могут при определенных условиях потребления вызвать токсический эффект, во — вторых, «загрязнители» — токсичные вещества, поступающие в пищу из окружающей среды вследствие нарушения технологии выращивания (кормление — для животных), производство или хранение продуктов или других причин.

Суть данной курсовой работы выражается во всестороннем изучении микотоксикантов и афлатоксинов в пшенице. В настоящее время контаминация продукции являются проблемой, так как нет эффективных химических способов борьбы с загрязнением продуктов урожая злаковых культур микотоксинами. Исходя из этого, контроль по показателям безопасности должен стоять на первом месте. Для этого предлагается использовать различные методики выявления микотоксинов.

микотоксин афлатоксин хроматография пшеница

Целью работы является — изучение вопросов практической организации проведения анализов и оценки афлатоксинов в пшенице для развития производства качественных и безопасных продуктов питания.

Основные задачи курсовой работы:

1) раскрыть актуальность оценки продукции на содержание афлатоксинов;

2) изучить этапы оценки сырья и продуктов на наличие афлатоксинов;

3) изучить методы определения микотоксинов в том числе и афлатоксина в пшенице;

4) выбрать наиболее подходящий способ выявления афлатоксинов.

1. Обзор литературы

Для здоровья человека наиболее опасным из микотоксинов считаются афлатоксины. Афлатоксины — продукты жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus flavus, поражающего кукурузу, другие виды зерна и семена масличных культур. Сущность биологического действия афлатоксинов на организм заключается в подавлении таких жизненно важных функций, как синтез белка и нуклеиновых кислот, нарушения синтеза липидов. Афлатоксины действуют непосредственно на оболочки клеток и мембраны различных цитоплазматических включений, обладают выраженным мутагенным и тератогенным эффектом, являются самым сильнодействующим из числа известных гепатоканцерогенов.

При потреблении пораженной афлатоксином пищи интоксикация ассоциируется с синдромом Рейа или оспой, которая поражает детей. Смертность при этом может достигать 80%. Некоторые исследователи связывают гепатит В с влиянием афлатоксина, предположительно изменяющим генетическую структуру ДНК, в результате чего вирус гепатита поражает клетку. Основным источником опасных для человека микотоксинов является кукуруза, пшеница, рис, арахис и другие, преимущественно масличные культуры. Микотоксины могут также переходить в продукты животного происхождения [8].

Изучение условий, способствующих или препятствующих росту и токсинообразованию плесневых грибов, представляет исключительно важную проблему, как для здравоохранения так и для народного хозяйства.

Для снижения уровня микотоксинов, содержащихся в кормах в опасных количествах, проводят их обезвреживание. В настоящее время методы обезвреживания подразделяются на физические, химические, биологические и комбинированные. Большинство физических и химических методов детоксикации дорогостоящие, требуют определенных производственных затрат, влияют на показатели качества кормов и не значительно снижают количество микотоксинов [10].

Интерес представляют биологические методы (обработка кормов живыми бактериями, бактериальными культурами) среди которых представлены аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus [12].

Провели изучение Иванов Е.Н., Матросова Л.Е., Иванов А.В. обезвреживающего действия микроорганизмов рода Bacillus и актиномицет в отношении афлатоксина В1 на искусственно контаминированном субстрате. Исследуемые штаммы микроорганизмов не патогены для животных. Для контаминирования кормов (концентраты) использовали токсигенный штамм Aspergillus flavus. Увлажненный субстрат контаминировали двухнедельной культурой гриба-продуцента афлатоксина В1 и инкубировали в термостате при температуре 26-27°C в течение 10 суток. В период ферментации 2 раза в день колбы с субстратом интенсивно встряхивали и автоклавировали при 1 атм. в течение 30 минут, помещали в бумажные пакеты, сушили при температуре 40-45°C и размалывали на лабораторной мельнице.

Определение токсина проводили методом двухмерной тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Содержание микотоксина в субстрате составляло — 0,5 мг/кг.

Корма, загрязненные микотоксинами, обрабатывали суточной культурой Bacillus subtilis — 2000 предназначенной для обработки концентрированных кормов с целью повышения усвояемости питательных веществ и расщепления антипитательных веществ.

Для этого из суточной культуры делали смыв физраствором в объеме 1 миллилитр и заливали контаминированный корм, полученную смесь перемешивали и оставляли на 24 часа. Контролем служит корм не подвергающийся обработке.

В результате проведенных исследований установлено, что используемые штаммы микроорганизмов обладали выраженной детоксицирующей активностью. В течение 24 часов происходило обезвреживание до 60% афлатоксина В1, концентрация микотоксина в контрольной пробе оставалась без изменений.

Таким образом, исследуемые штаммы микроорганизмов обладают детоксицирующей активностью по отношению к афлатоксину В1, что является перспективным для разработки новых биопрепаратов для обезвреживания кормов от микотоксинов [3].

В 2007-2008 гг. ФГУ ”Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных” Садыковой В.Н., Танасевой С.А., Шангараевым Н.Г. проведены исследования 1537 проб кормов, отобранных из 18 районов Республики Татарстан в различных техногенных зонах. Исследовались комбикорма, зернофураж различного состава, пшеница, ячмень, овёс, рожь, горох, сено, сенаж, силос. Анализы проведены с помощью хроматографических методов — ТСХ и ВЭЖХ.

Афлатоксин В1 находился в 12,6% кормов, концентрация микотоксина варьировала от 0,002 до 0,81 мг/кг. Наиболее часто микотоксин обнаруживался в комбикормах, сенаже и силосе. В комбикормах афлатоксин присутствовал в основном за счет включения в рацион привозных добавок — шрота соевого и жмыха подсолнечного, так большинство проб шрота соевого (84%) содержали афлатоксин В1 в концентрациях до 0,24 мк/кг, в 42,7% образцов жмыха подсолнечного микотоксин был обнаружен в концентрациях до 0,18 мк/кг. Однако и в кормах собственного приготовления из местных ингредиентов также присутствовал микотоксин, но при этом его концентрация не превышала 0.035 мк/кг. Следует отметить, что нарушение технологии приготовления сенажа и силоса привело к тому, что в них часто выявлялся афлатоксин В1, последующие микологические исследования показали высокую загрязненность кормов микроскопическими грибами — продуцентами афлатоксинов.

Хозяевам, неблагополучных по санитарному качеству кормов, были даны рекомендации по рациональному их использованию, обезвреживанию и в отдельных случаях их утилизации [7].

В работе Сеидовой Г.М. приведены результаты иммуноферментного (ИФ) анализа уровня загрязнения микотоксинами грибов рода Aspergillus продуктов детского питания. Всего проанализировано 12 видов продуктов детского питания (молочные смеси фруктовые пюре), импортируемых из России, Германии и Швейцарии. Полученные данные в целом свидетельствуют о том, что афлатоксины в различной степени выраженности присутствуют во всех изученных пробах.

Продукты детского питания, импортируемые из России были более контаминированы афлатоксинами, чем из Швейцарии и Германии. Так содержание суммарных афлатоксинов в фруктовом пюре с яблоком фирмы «Агуша» в некоторых пробах достигает уровня 2,15 мкг/кг, что значительно превосходит допустимые нормы контаминации в 1,0 мкг/кг афлатоксинов для продуктов детского питания. Из 5 наименований продукции этой фирмы только один продукт (фруктовое пюре с грушей) отвечает современным требованиям. По сравнению с этим, фруктовые пюре фирмы «Фруттоняня” выглядят предпочтительнее, хотя и в них уровень контаминации в некоторых случаях на 20-30% превышает допустимые нормы. С другой стороны, продукты детского питания на основе молочных смесей были контаминированы значительно сильнее, чем на основе фруктовых пюре и других основ. Наиболее демонстративны в этом отношении продукты детского питания фирмы «Винни”. Максимальное количество афлатоксинов (2,17 мкг/кг) было обнаружено в молочной смеси «Рисовая плюс гречневая» и в молочной смеси «Овсяная» (2,76 мкг/кг). По сравнению с продуктами российского производства, продукты из Швейцарии и Германии значительно менее подвержены контаминации афлатоксинами, это относится как к фруктовым пюре, так и молочным смесям. Только один вид швейцарской продукции — молочная смесь «Гречневая”, содержал афлатоксины в количестве 1,21 мкг/кг, что превышает предельно-допустимую норму. Дальнейший анализ накопленных данных показал, что частота встречаемости контаминированных проб также различна для продукции различных фирм-производителей. Чаще всего афлатоксины были выявлены в продуктах фирмы «Агуш” где вероятность обнаружения микотоксинов достигает 22%, в то время как для продуктов из Швейцарии этот показатель составляет не более 9,9% из общего числа изученных проб. Результаты исследования заставляют прийти к выводу о необходимости систематического санитарно-гигиенического контроля уровня контаминации микотоксинами пищевых продуктов детского питания [9].

По исследованию Мишиной Н. Н, Семенова Э.И., Тремасова М.Я. проблема охраны здоровья сельскохозяйственных животных становится одной из гласных в системе животноводства. По некоторым оценкам, примерно четверть зерновых, производимых во всем мире, поражена микотоксинами. При длительном поступлении загрязненных зерновых в организм животных в дозах, меньших допустимых уровней могут вызвать хронический микотоксикоз, характеризующийся отсутствием ярких клинических признаков, но сопровождается резким снижением продуктивности и отходом молодняка сельскохозяйственных животных.

В этой ситуации не всегда удается вовремя диагностировать заболевание, и очевидно, что необходимы эффективные профилактические меры по предотвращению развития острого микотоксикоза.

Эффективной мерой борьбы с уже имеющимися в кормах микотоксинами является использование специальных добавок (энтеросорбентов), которые адсорбируют токсины, препятствуют их всасыванию в желудочно-кишечном тракте животных, и выводятся с каловыми массами, мочой.

Однако большинство препаратов, представленных на современном рынке не всегда экономически выгодны для массового применения, в частности, минеральные сорбенты не обладают избирательной сорбцией и вместе с микотоксинами могут выводить и питательные вещества, и их целесообразней применять только в случаях острых микотоксикозов [11].

Ученые из Казани в качестве средства профилактики микотоксикозов изучался сорбент «Фитосорб” (на основе клетчатки оболочки зерна злаков).

Целью данной работы явилось изучение влияния нового сорбента на течение смешенного Т-2 и афлатоксикоза у животных.

Исследования проводились на 3 группах крыс с исходной массой около 150 грамм. Первая группа служила биологическим контролем; крысам 2 группы задали рацион, контаминированный Т-2 токсином (1/50 ЛД50) и афлатоксином В1 (1/50 ЛД50); 3 группа получала Т-2 токмин (1/50 ЛД50), афлатоксин В1 (1/50 ЛД50) и энтеросорбент «Фитосорб” в количестве 0,5% от рациона. Продолжительность опыта составило 30 суток.

Исследования показали, что во второй группе произошло статистически достоверное уменьшение эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина на 30 сутки — на 20%; 21,4%; 11,45% соответственно, тогда как в первой и третьей группах зарегистрировано снижение на 3 и 8%; 5,5 и 8,5; 1,77 и 1,71% соответственно.

Произошло снижение уровня глюкозы у крыс второй группы на 21,4%, и повышение активности щелочной фосфатазы на 24,9%, аминотрансфераз-АЛТ и АСТ — на 16,6 и 40,8 соответственно, которые свидетельствуют о выраженном дегенеративном поражении печени и миокарда, и нарушении углеводного обмена. В тоже время статистически достоверное повышение активности щелочной фосфатазы на 1,6 и 18,2%, АЛТ на 5,9 и 23,4%, АСТ — 7,1 и 20,7% в первой и третьей группах к 30 суткам. Данные показатели свидетельствуют о снижении проявления токсического действия задаваемых микотоксинов на фоне рациона с сорбентом.

Сочетанное воздействие микотоксинов, за весь период исследования оказало негативное влияние на минеральный обмен животных. Так, в группе крыс, получавших совместно Т-2 и афлатоксин, наблюдалось снижение общего кальция в крови к 30 суткам на 20,2%, и повышение неорганического фосфора на 22,6%; в то время как, в сыворотке крови крыс получавших сорбент с первого дня исследования отметили повышение общего кальция на 4% и неорганического фосфора на 5,7% по сравнению со второй группой.

При этом во второй группе сохранность животных составила 66,67% в то время как в других группах 100%, к тому же у всех крыс, получавших токсин без сорбента наблюдались выраженные клинические признаки токсикоза в виде угнетения, анорексии и диареи, в то время как, менее выраженная клиническая картина была у 60% животных 3 группы, которая восстановилось к 21 дню опыта.

Результаты исследований свидетельствуют, что энтеросорбент способствует сохранению функциональной активности ферментов, регуляции углеводного и минерального обменов, положительно влияет на гематологические и биологические показатели животных, и является перспективным препаратом для его дальнейшего исследования в качестве профилактического средства при микотоксикозах [9].

Существуют и иновационная диагностика афлафтоксина В1 в продуктах питания. Микотоксикозы, вызванные плесневыми грибами, занимают одно из лидирующих положений среди микробных интоксикаций. В прошлом веке регистрировались случаи острой интоксикации людей афлатоксинами. Так в 1982 году в Кении (Африка) было зафиксировано массовое отравление людей, употребляющих в пищу продукты питания, обсеменённые грибами Aspergillus fumigatus. Из 20 официально зафиксированных случаев острого афлатоксикоза 12 явились летальными. Исследование показало, что в продуктах питания, употребляемых больными, было обнаружено высокое содержание микотоксинов, в частности афлатоксин В1 (присутствовал в количестве 3,2 — 12 мг/кг). В последнее десятилетие отравления афлатоксинами носят хронический характер. Всё вышеперечисленное доказывает актуальность разработки новых подходов своевременного обнаружения плесневых грибов в окружающей среде, с целью усиления эпидемического надзора и предупреждения возникновения пищевых отравлений.

С целью разработки инновационного подхода к определению афлатоксина в окружающей среде и продуктах питания Жернов Ю.В. провел следующее исследование. Задачей исследования стала оценка фотоколориметрического метода определения афлатоксина. Новизна работы заключается в том, что диагностика микотоксинов в настоящее время осуществляется в основном методом жидкостной хроматографии, что является более трудоемким и менее коммерчески выгодным методом, по сравнению с фотоколориметрией.

В основу работы легла идея, заключающаяся в том, что патогенные и условнопатогенные грибы рода Aspergillus в процессе жизнедеятельности вырабатывают токсические метаболиты (микотоксины), на которые можно поставить качественные химические реакции.

В своем исследовании Жернов Ю.В. использовал ГСО 7936-2001 раствор афлатоксина В1 в смеси бензола и ацетонитрила. Так как микотоксины относятся к вредным веществам 2 и 3 класса опасности, им были соблюдены общие требования безопасности согласно ГОСТ 12.1.007-76.

Изучение химической формулы афлатоксинов позволило отнести их к производным кумаринового (2-хроменонового) ряда. Постановка качественной химической реакции на афлатоксин велась по схеме:

1. Реакция афлатооксина со щелочью, в результате чего лактонный компонент кумаринового ядра афлатоксина раскрывается с образованием карбоксильной и гидроксильной (фенольной) групп;

2. Качественная реакция на образовавшийся фенольный компонент кумаринового ядра афлатоксина с солью железа, в результате чего образуется комплексное соединение афлатоксинолята железа. В результате реакции цвет раствора с бесцветного на первом этапе меняется на желтый, а на втором на оранжево-желтый, что диагностируется как визуально органолептически, так и фотоколориметрически.

Фотоколометрическое исследование проводилось при длине волны 540 нм., относительно контроля — дистиллированной воды (оптическая плотность D= 0,000). Данные показывают, что при внесении афлатоксина (2,5 мкг/мл) D равнялось 0,015. При добавлении к раствору афлатоксина щелочи D составило 0,027, а при дальнейшем добавлении хлорида железа D равняется 0,121.

Таким образом, разработанная методика определения афлатоксина в окружающей среде и продуктах питания позволит усилить превентивный эпидемический надзор за заболеваниями и отравлениями, вызванными патогенными грибами рода Aspergillus, а также поможет создать дифференциально-диагностическую среду для определения афлатоксинпродуцирующих видов грибов [13].

Из всего выше сказанного можно сделать следующий вывод. Одними из сильнейших канцерогенов являются продукты жизнедеятельности плесневых грибов — микотоксины, которых на сегодняшний день известно множество разновидностей и среди них особо выделяется группа афлатоксинов. Из всех биологически производимых ядов, афлатоксины являются самыми сильными гепатоканцерогенами, вызывающими необратимые поражения печени. Из данных исследований понятно, что микотоксины обнаруживаются в продуктах питания человека и животных и даже в детском питании. Существующие методы определения и снижения микотоксинов постоянно дополняются. Разрабатываются препараты в качестве профилактического средства при микотоксикозах.

2. Специальная часть

2.1 Этапы оценки продукции с целью обнаружения микотоксинов, в том числе афлатоксинов

Существующие методы оценки экологической безопасности продукции включает следующие этапы.

1) Отбор точечных проб (выемок) и формирование объединенной партии.

2) Пробоподготовка.

3) Выполнение анализа по количественному определению микотоксинов.

Точечная проба — небольшое количество зерна, отобранного из одного места за один прием для составления объединенной пробы.

Объединенная проба — совокупность всех точечных проб, отобранных из партии зерна.

Среднесуточная проба — проба, формируемая при поступлении от одного колхоза или глубинного пункта в течение оперативных суток нескольких однородных по качеству автомобильных партий зерна.

Средняя проба — Часть объединенной пробы, предназначенная для проведения качества партии. Для небольших партий зерна объединенная проба одновременно является и средней пробой.

Навеска — часть средней пробы, выделенная определения отдельных показателей качества зерна.

Оперативные сутки — 24 часа, исчисляемые с установленного часа, в течение которых формируют среднесуточные пробы.

Для отбора, формирования проб и выделения навесок применяют следующею аппаратуру: пробоотборники и щупы различных конструкций, исключающие травмирование зерна; весы лабораиорные с подгрешностью взвешивания не более 0,01 по ГОСТ 24104-88; весы с пределом взвешивания до 20 кг по ГОСТ 29329-92; ковши вместимостью не менее 200 смі; делители; планки деревянные; совки; емкости для проб и навесок [2].

Отбор точечных проб

Отбор точечных проб. Отбирают механическим пробоотборником или вручную щупом.

1) Из автомобилей с длиной кузова до 3,5 м точечные пробы отбирают в четырех точках по схеме А, с длиной кузова от 3,5 до 4,5 м — в шести точках по схеме Б с перестановкой автомобиля на шаг отборника и последующим опусканием одной пары норий, с длиной кузова от 4,5 м и более — в восьми точках по схеме В на расстоянии от 0,5 до 1 м от переднего и заднего бортов и на расстоянии около 0,5 м от боковых бортов:

Механическим пробоотборником точечные пробы отбирают по всей глубине насыпи зерна. Ручным щупом точечные пробы отбирают из верхнего и нижнего слоев, касаясь щупом дна.

В автопоездах пробы отбирают из каждого кузова (прицепа).

Общая масса точечных проб при отборе по схеме А должна быть не менее 1 кг, по схеме Б — не менее 1,5 кг и по схеме В — не менее 2 кг.

Если общая масса будет менее указанной, отбирают дополнительные точечные пробы в тех же точках в среднем слое насыпи.

2) Точечные пробы зерна, хранящиеся в складах и на площадках при высоте насыпи до 1,5 м, отбирают ручным щупом, при большей высоте насыпи — складским щупом с навинчивающимися штангами. Для этого поверхность насыпи зерна делят на секции площадью примерно 200 мІ каждая и в каждой секции точечные пробы отбирают в шести точках поверхности на расстоянии 1 м от стен склада (края площадки) и границ секции и на одинаковом расстоянии друг от друга по схеме Б. При небольших количествах зерна в партии допускается точечные пробы отбирать в четырех точках поверхности секции площадью до 100 мІ по схеме А.

В каждой точке точечные пробы отбирают из верхнего слоя на глубине 10 — 15 см от поверхности насыпи, из среднего и нижнего (у пола) слоев. Общая масса точечных проб должна составлять около 2 кг на каждую секцию.

3) Точечные пробы при погрузке (выгрузке) зерна в вагоны, суда, склады и силосы элеватора отбирают из струи перемещаемого зерна в местах перепада механическим пробоотборником или специальным ковшом путем пересечения струи через равные промежутки времени в течение всего периода перемещения партии. Периодичность отбора точечных проб устанавливают в зависимости от скорости перемещения, массы партии, а также состояния по засоренности. Масса одной точечной пробы должна быть не менее 100 г.

4) Отбор проб из мешков. Количество мешков, из которой должны быть отобраны точечные пробы, определяют в зависимости от величены партии.

Из защитных мешков точечные пробы отбирают мешочным щупом в трех доступных точках мешка. Щуп вводят по направлению к средней части мешка желобком вниз, затем поворачивают его на 180? и вынимают.

Образовавшееся отверстие заделывают крестообразным движением острия щупа, сдвигая нити мешка.

Общая масса точечных проб должна быть не менее 2 кг [2].

Составление объединенной пробы

1) Объединенную пробу получают как совокупность точечных проб. Все точечные пробы ссыпают в чистую, крепкую, незараженную вредителями хлебных запасов тару, исключающую изменение качества зерна.

2) При использовании механического пробоотборника для отбора проб из автомобилей точечные пробы смешиваются в процессе отбора проб, и образуется объединенная проба.

3) В тару с объединенной пробой зерна, за исключением проб, отобранных из автомобилей, вкладывают этикетку с указанием: наименования культуры; номер склада, силоса, вагона или названия судна; даты отбора пробы; массы пробы; подписи лица, отобравшего пробу [2].

Формирование среднесуточной пробы

1) При поступлении от одного пункта в течение оперативных суток нескольких однородных по качеству автомобильных партий зерна формируют среднесуточную пробу.

2) Однородность автомобильной партии зерна по сравнению с ранее поступившими устанавливают органолептически, а по влажности и зараженности — на основании результатов лабораторных анализов. Если органолептическая оценка вызывает сомнение, пробу подвергают лабораторному анализу по всем показателям.

3) Среднесуточную пробу формируют путем выделения из объединенных проб, отобранных от каждого автомобиля, части зерна из расчета 50 г на каждую тонну доставленного зерна.

4) Среднесуточную пробу формируют в чистой, герметичной емкости, на которой должны быть указаны: наименование хозяйства, номер бригады, культура, сорт, дата.

5) Объединенная проба из первого автомобиля должна быть не менее 2 кг и после выделения части зерна для среднесуточной пробы должна сохраниться до конца формирования среднесуточной пробы.

Если при незначительном поступлении автомобилей среднесуточная проба окажется менее 2 кг, она дополняется зерном из объединенной пробы первого автомобиля [2].

Выделение средней пробы

1) Масса средней пробы должна быть (2,0 ± 0,1) кг, а при применении анализатора У1-ЕАЗ — (3,0 ± 0,1) кг.

Если масса объединенной или среднесуточной пробы не превышает 2,0 кг или 3,0 кг, то она одновременно является и средней пробой.

Если масса объединенной или среднесуточной пробы превышает 2,0 кг, то выделение средней пробы из объединенной проводят на делителе.

2) Допускается составление средней пробы ручным способом. Для этого объединенную пробу высыпают на стол с гладкой поверхностью, распределяют зерно в виде квадрата и смешивают его при помощи двух коротких деревянных планок со скошенным ребром.

Смешивание проводят так, чтобы зерно, захваченное с противоположных сторон квадрата на планки в правой и левой руках, ссыпалось на середину одновременно, образуя после нескольких перемещений валик. Затем зерно захватывают с концов валика и одновременно с обеих планок ссыпают на середину. Такое перемешивание проводят три раза.

После троекратного перемешивания объединенную пробу снова распределяют ровным слоем в виде квадрата и планкой делят по диагонали на четыре треугольника. Из двух противоположенных треугольников зерно удаляют, а в двух оставшихся собирают вместе, перемешивают указанным способом и вновь делят на четыре треугольника, из которых два идут для следующего деления до тех пор, пока в двух треугольниках не будет (2,0 ± 0,1) кг или (3,0± 0,1) кг зерна, которое и составит среднюю пробу.

3) При отборе от большой однородной партии зерна при погрузке (выгрузке) судна среднюю пробу составляют следующим образом: из точечных проб, отобранных за определенный отрезок времени (час или два), составляют промежуточную пробу, которую тщательно смешивают, и выделяют из нее среднюю пробу массой (2,0 ± 0,1) кг или (3,0 ± 0,1) кг для проверки отдельных показателей качества. К концу смены или суток все средние пробы, выделенные из промежуточных, объединяют и из них выделяют среднюю пробу за смену — среднесменную, по которой проводится анализ по всем показателям качества.

После окончания погрузки (выгрузки) подсчитывают средневзвешенное качество по всем среднесменным пробам, на основании которого выписывают удостоверение о качестве партии зерна в трюме или пароходе.

При разгрузке зерна из судов непосредственно в вагоны удостоверения о качестве на партию зерна в трюме или пароходе выписывают на основании средневзвешенного качества всех партий зерна, отгруженных в вагон. Из средних проб одновременно выделяют пропорциональную часть зерна для составления общей пароходной пробы.

4) Выделенную среднюю пробу осматривают в лаборатории, взвешивают, регистрируют и дают ей порядковый номер, который поставляют в карточке для анализа и во всех документах, относящихся к данной пробе [2].

Подготовка средней пробы и выделение навесок для анализов

1) Из средней пробы выделяют навеску для определения влажности, затем среднюю пробу взвешивают до десятых долей грамма и очищают от крупной сорной примеси.

2) Из очищенной от крупной сорной примеси средней пробы с помощью делителя выделяют навески для проведения анализов.

3) Если масса навески, выделенной на делителе, превышает более чем на 10 % требуемую массу, излишек зерна отбирают следующим образом: выделенную порцию зерна высыпают на гладкую поверхность, разравнивают тонким слоем и плоским совочком отбирают излишек из разных мест по всей толщине слоя. Излишек зерна в навеске до 10 % отбирают совочком с чашки весов из разных мест, предварительно разравняв навеску.

4) Если масса навески, выделенная на делителе, менее требуемой величины, то корректируют установку зазора на шкале и выделение навески повторяют.

5) Для получения навесок массой менее 25 г выделенные на делителе 25 г зерна переносят на анализную доску, троекратно перемешивают, распределяют ровным слоем в виде квадрата и при помощи планок делят по диагонали на четыре треугольника. Из двух противоположных треугольников зерно удаляют, а в двух оставшихся собирают вместе, перемешивают и вновь делят на четыре треугольника, из которых два идут для последующего деления до тех пор, пока масса зерна в двух оставшихся противоположных треугольниках не будет превышать установленную массу.

6) Допускается смешивание средней пробы зерна и выделение из нее навесок ручным способом до тех пор, пока масса зерна в двух оставшихся противоположных треугольниках не будет превышать массу, установленную для проведения анализа [2].

Порядок и сроки хранения проб

1) Средние пробы, выделенные из среднесуточных проб зерна, хранят в течение одних суток, следующих за сутками, в течение которых проводились анализы среднесуточных проб.

2) Средние пробы от партии зерна, отгруженных по назначениям (кроме местного), необходимо сохранять 1 месяц, а при разногласиях пробы хранят до полного рассмотрения разногласий. Пробы от партии зерна, отгруженных на местное снабжение, не сохраняют.

3) Пробы от партии зерна, отгруженных на экспорт, сохраняют в течение 3 месяцев при отгрузке железнодорожным транспортом и 6 месяцев — водным транспортом.

4) Пробы от партии, поступивших водным транспортом из-за рубежа, сохраняют в течение 3 месяцев [2].

2.2 Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные, аналитические и биологические методы. Методология микотоксинов развивается очень быстро. Число разработанных методов и различных модификаций достигло уже нескольких сотен и продолжает нарастать.

Скрининг-методы, отличающиеся простотой и быстротой проведения анализов, позволяют быстро и надежно «отсеивать» незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный способ выявления афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; ТСХ-методы для одновременного определения до 30 различных микотоксинов; флюоресцентный метод обнаружения загрязнения афлатоксинами, и др.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов могут быть подразделены на химические, радиоиммунохимические и иммуноферментные. Химические методы в настоящее время являются наиболее распространенными и включают последовательные стадии выделения и собственно количественного определения микотоксинов. Стадия выделения состоит из двух этапов: экстракция — отделение микотоксина от субстрата, и очистка — отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками. Окончательное разделение микотоксинов осуществляют с помощью одно — или двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем в различных системах растворителей, газовой и газо-жидкостной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс — спектрометрии. Количественное определение микотоксинов проводят обычно путем прямого сравнения интенсивности флюоресценции при ТСХ в ультрафиолете со стандартами известной концентрации как визуально, так и денситометрически. Для повышения надежности методов применяют различные подтверждающие тесты, основанные на получении производных микотоксинов с иными хроматографическими, колометрическими или флюориметрическими характеристиками.

Последние годы характеризуются усилением внимания к разработке высокочувствительных и высокоспецифических радиоиммунохимических и иммуноферментных методов обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгантам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Преимуществом их является исключительная чувствительность, позволяющая выявлять пикограммы микотоксинов, и вести разработки в направлении автоматизации процесса определения. Биологические методы, обычно не отличающиеся высокой специфичностью и чувствительностью, применяются главным образом для выявления микотоксинов, для которых отсутствуют химические методы анализа, или в качестве подтверждающих тестов. Тест-объектами служат различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, многие лабораторные животные, культуры клеток и тканей [4].

2.3 Определение афлатоксинов в пшенице методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Отбор проб проводят по ГОСТ Р 53162-2008 (ИСО 16050: 2003). Размер средней пробы для пшеницы от партии массой до 50 т должна составлять от 1 до 10 кг [1].

Экстракция

Взвешивают 25 г гомогенизированной пробы, с точностью 0,1 г в сосуде блендера. Добавляют 5 г хлорида натрия и 125 смі растворителя для экстракции и гомогенизируют с помощью перемешивающего устройства в течение 2 мин при высокой скорости. Контролируют, чтобы время и скорость перемешивания не оказывали негативного влияния на эффективность экстракции. Смесь фильтруют через рифленую фильтровальную бумагу (V1).

Отбирают пипеткой 15 смі (V2) фильтрата в коническую колбу подходящего размера со стеклянной пробкой. Добавляют 30 смі воды, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Перед проведением аффинной колоночной хроматографии разбавленный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу из стекло-микроволокна. Фильтрат должен быть прозрачным. Если это не так, проводят повторную фильтрацию. Незамедлительно следуют процедурам, описанным в разделе «экстракция”.

Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу [1].

Очистка

Готовят IA колонку и осуществляют процедуру очистки в соответствии с инструкциями производителя. Отбирают пипеткой 15 смі (V4) второго фильтрата (V3) в емкость для растворителя IA колонки. Пропускают его через разделяющую колонку, затем промывают колонку, как это описано в инструкциях производителя, и удаляют элюаты. Начинают проводить элюирование афлатоксинов. Собирают этанольный или ацетонитрильный элюат (в зависимости от продукта или инструкций производителя) в мерной колбе вместимостью 2 смі (или другого объема, установленного производителем). Разбавляют до метки водой (V5).

Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются, в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.

Примечание: в целом, процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).

Допускается использовать традиционные колонки с силикагелем или колонки твердофазной экстракции. В этих случаях также необходимо четко следовать инструкциям производителя. Если растворитель, применяемый для элюирования афлатоксинов, не совместим с подвижной фазой, то элюат необходимо выпарить до сухого остатка в токе азота при температуре ниже 40°С. Остаток необходимо растворить в подвижной фазе и разбавить до 2 смі или до того объема, который установлен производителем.

Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена [1].

Условия работы при выполнении ВЭЖХ

Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору. Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70°С.

В случае использования колонки, подходящими являются следующие параметры:

скорость потока подвижной фазы (колонка): 1,0 смі/мин;

скорость потока послеколоночного реагента: 0,3 смі /мин;

впрыскиваемый объем: 50 мкл.

Дают всей системе функционировать 10-20 мин для ее стабилизации. Если используется интегратор, настраивают регулировку чувствительности флуоресцентного детектора или интегратора, чтобы получить соответствующий сигнал: шум 5: 1 для 0,125 нг афлатоксина G2 в 50 мкл. Если используется регистрирующий прибор с ленточной диаграммой, настраивают регулировку флуоресцентного детектора таким образом, чтобы получить для 0,125 нг афлатоксина G2 в 50 мкл от 30% до 40% шкалы регистрирующего прибора [1].

Идентификация

Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями соответствующих стандартов.

Афлатоксины можно идентифицировать одновременным вводом раствора испытуемой пробы и градуировочных растворов. Кроме того, при идентификации помогает исчезновение пиков афлатоксинов В1 и G1 в случае, когда не проводится добавка реагента для дериватизации [1].

Определение

Количественное определение проводится методом внешнего стандарта с интегрированием площади пика или измерением высоты пика, которые далее соотносятся с соответствующими значениями для стандарта.

В петлю инжектора вводят 50 мкл стандартного раствора в соответствии с инструкциями производителя инжектора. Афлатоксины элюируют в порядке G2, G1, B2 и В1 с временем удерживания приблизительно 6, 8, 9 и 11 мин соответственно. Пики должны быть разделены до базовой линии. При необходимости регулируют значения времени удерживания путем изменения концентрации метанола подвижной фазы.

Вводят 50 мкл (V6) очищенного экстракта образца в инжекторную петлю [1].

Обработка результатов

Рассчитывают массу mt, г, анализируемой пробы, присутствующей во фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V4), по формуле

mt = m0 * (V2 * V4) / (V1 * V3) (1),

где m0 — масса пробы образца, г (m0=25 г);

V1 — общий объем первого фильтрата, см (V1=125 смі);

V2 — объем фракции первого фильтрата, взятый для разбавления, смі (V2=15 смі);

V3 — общий объем второго фильтрата, смі (V3=45 смі);

V4 — объем фракции второго фильтрата, смі (V4=15 смі).

Рассчитывают массовую долю каждого афлатоксина wi, в микрограммах на килограмм пробы, вычисляют по формуле (метод внешнего стандарта)

wi = (V5 * mi) / (V6 * mt) (2),

где V5 — объем элюата, мкл (V5=2000 мкл);

V6 — объем очищенного и введенного экстракта образца, мкл (V6=50 мкл);

mi — масса данного афлатоксина, присутствующего в введенном объеме, соответствующая измеренной площади пика или высоте пика, определяемая по градуировочной характеристике, в нанограммах;

mt — масса анализируемой пробы, г, соответствующей фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (V4) [см. формулу (1)].

Для получения массовой доли суммы афлатоксинов суммируют массовые доли четырех афлатоксинов [1].

Заключение

В целом вопросы безопасности пищевых продуктов включают в себя довольно широкий спектр проблем, которые в последние десятилетия в обществе, в том числе научных и научно-популярных изданиях, обсуждаются довольно широко. Исследования в этой области в последнее время в связи с ухудшением экологической обстановки проводятся в широких масштабах, однако не всегда имеют системный подход.

Основными путями решения этой актуальной задачи являются следующие:

пересмотр нормативной документации, регламентирующей критерии и методы оценки качества и безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья;

разработка ускоренных методов анализа, приемлемых для широкого практического применения. С экономической точки зрения необходимо создание отечественных тест-наборов, тест-систем и измерительной аппаратуры, которые были бы дешевле импортных и доступны для производственных лабораторий;

постепенный переход от контроля готовой продукции к предварительному контролю на стадии ее производства, позволяющему существенно снизить затраты на проведение исследований и прогнозировать качество и безопасность продовольственного сырья и пищевой продукции;

разработка системы экологического регионального мониторинга объектов окружающей среды (почва, вода, воздух), оказывающих непосредственное влияние на качество и безопасность сельскохозяйственной продукции;

исследовательских учреждений с учетом приоритета разработок в области методического обеспечения оценки качества и безопасности продовольственного сырья и пищевой продукции.

Таким образом, в настоящее время стратегию безопасности пищевых продуктов определяет предупреждение загрязнения и заражения — как химического, так и биологического, на всех стадиях и ступенях пищевой цепи.

Список использованной литературы и источников

1. ГОСТ Р 53162-2008 (ИСО 16050: 2003). Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. ГОСТ 13586.3-83. Зерно. Правила приемки и методы отбора проб.

3. Иванов, Е.Н. Использование микроорганизмов для детоксикации афлатоксина В1/Е.Н. Иванов, Л.Е. Матросова, А.В. Иванов. — Казань.: ФГУ, 2015. — 53-59 с.

4. Комаров, А.А. Новый метод количественного определения афлатоксина В1 в кормах для мелких домашних животных / А.А. Комаров, Д.М. Осокин. — М.: ВГНКИ, 2015. — 115 с.

5. Мишина, Н.Н., Проблема профилактики смешанного Т-2 и афлатоксикоза / Н.Н. Мишина, Э.И. Семенов, М.Я. Тремасов. — Казань.: ФГУ, 2015. — 309-318 с.

6. Монастырский, О.А. Токсинообразующие грибы и микотоксины. Защита и карантин растений. 2006. — 321 с.

7. Садыкова, В.Н. Микотоксины / В.Н. Садыкова, С.А. Танасева, Н.Г. Шангараев. — Казань.: ФГУ, 2015. — 96-100 с.

8. Самойлова, В.В. Влияние микотоксинов на организм пуховых коз. Иммунодиагностика и иммунотерапия хронических заболеваний / В.В. Самойлова, Ш.М. Биктеев, М.С. Сеитов, Е.В. Жулькина. — Оренбург. 2013. — 34 с.

9. Сеидова, Г.М. Микробиология и иммунология / Баку.: 2015. — 203-210 с.

10. Симонова, И.А. Морфологические изменения крови крыс при включении в рацион кормов, контаминированных микотоксинами // Международная научно-практическая конференция «Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития», посвященная 80-летию со дня образования Дагестанского государственного аграрного университета имени Джамбулатова М.М. — Махачкала, 2013. — С.11.

11. Симонова, И.А. Случай отравления свиней кормами, контаминированными микотоксинами // Современные проблемы и инновационные подходы к диагностике, лечению и профилактике болезней животных и птиц: материалы международной научно-практической конференции «Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве». — Екатеринбург, 2012. — С.1.

12. Симонова, И.А. T-2-сочетанные микотоксикозы животных и детоксикация кормов, контаминированных микотоксинами, с применением озон/NO-технологий. — Омск, 2013 — С.65.

13. Жернов, Ю.В. Инновационная диагностика афлатоксина В1 грибов рода Aspergillus в продуктах питания. — Самара.: ФГУЗ, 2015. — 400 с.