Изучение способов иммобилизации молекул ДНК на подложках из различных материалов

Химический синтез олигонуклеотидных проб осуществляется на поверхности кварцевого стекла. Эта технология позволяет обеспечить высокоплотное размещение проб –на одной ДНК-матрице размером 1,28х1,28 см порядка 500 000. Для изготовления матриц GeneChip применяют комбинацию уникального метода фотолитографии и методов комбинаторной химии. Так как 25-мерные последовательности для ген-специфичной гибридизации являются слишком короткими, каждую пробу (match) сопровождает отрицательный контроль с одним отличным основанием в центре 25-мерной нуклеотидной цепи (mismatch). Такую пару проб используют для детекции и предотвращения кросс-гибридизации.
Сеть олигонуклеотидов из 11-15 проб (перфектов) и такого же числа парных олигонуклеотидов с заменами (мисматчей) представляют один ген. Высокая плотность размещения проб на такой матрице обеспечивает наличие большого количества контролей. Автоматизированным процессом изготовления матриц GeneChip гарантируется высокая воспроизводимость результатов и обеспечение варьирования условий проведения каждого эксперимента. Обычно ДНК-матрицы гибридизируются с двумя различными флуоресцентно-мечеными мишенями (в качестве метки используется пара Cy-3/Cy-5), чипы Affymetrix – с одной меченой мишенью. Это позволяет применять разные методы для мечения ДНК-мишеней, упрощает исследования и статистическую обработку результатов.Для независимого синтеза ДНК-зондов, среди которых выделяют двухцепочечные фрагменты ДНК и олигонуклеотиды, используют различные методы [9, 10]. Один из них – полимеразная цепная реакция – позволяет получить ген-специфичные ампликоны размером от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований.
Обычно, при использовании специфических праймеров осуществляется амплификация открытых рамок считывания, представляющих собой потенциальные белок-кодирующие последовательности. Для иммобилизации на ДНК-матрицах оптимальная длина ампликонов составляет 200-800 пар оснований, хотя фрагменты длиной до 1,3 тысяч пар оснований также используются. В таких матрицах каждый ДНК-зонд соответствует одному гену [11].
Двухнитевые фрагменты ДНК наносят на положительно заряженную поверхность ДНК-матриц. Для модификации поверхности матриц обычно используют полилизин (poly-L-lysin) или 3-аминопропил-триметоксисилан (APS).
Иммобилизация фрагментов ДНК на поверхности матрицы осуществляется благодаря электростатическому взаимодействию отрицательно заряженного фосфатного остова нуклеиновой кислоты и положительно заряженной поверхности матрицы, а также за счет образования ковалентных связей между остатками тимина и аминогруппами, расположенными на поверхности матрицы, при облучении ультрафиолетом [12].
Преимуществами изготовленных таким образом матриц являются высокая специфичность при гибридизации, высокая чувствительность и их низкая стоимость. В качестве альтернативы некоторые коммерческие поставщики предлагают большие коллекции 50-80-мерных олигонуклеотидов, синтезированных фосфорамидным методом. И в том, и в другом случае автоматическая локализация ДНК-зондов, находящихся в специальном буфере, на химически модифицированную поверхность матрицы осуществляется механическими роботами.
Существуют две технологии нанесения: контактная и бесконтактная. Контактные роботы-принтеры наносят ДНК-зонды на поверхность матриц пинами различной формы, которые погружаются в раствор и переносят маленькие капельки специфических ДНК-зондов на поверхность матрицы. Размер локализованных таким образом ДНК-зондов составляет всего 150 мкм в диаметре. Бесконтактные принтеры используют технологию типа струйного принтера. Основное преимущество таких матриц – их стандартные размеры, что обеспечивает широкий выбор роботов-принтеров, оборудования для проведения гибридизации, лазерных сканеров и программного обеспечения для обработки результатов эксперимента. Исторически первым было изготовление ДНК-матрицы на предметном стекле, поэтому размер матриц 25×75 мм и толщина 1,0-1,2 мм не изменились. Однако плотность размещения ДНК-зондов на таких матрицах ниже по сравнению с матрицами Affymetrix – порядка 10 000-30 000 ДНК-зондов.