Для устранения искажения результатов содержащимися в больших концентрация в исследуемых биологических препаратах солей применяют раствор глицина в концентрации 1-2%, растворы амфолинов, фармалитов, сервалитов, биолитов в той же концентрации, а также деинизированную воду как растворители для образцов. В этих же целях проводят диализ, гель-фильтрацию или используют центрифужные концентраты.
Время завершения процесса изофокусирования определяют по появлению полос в точках нанесения на гель одновременно с исследуемым образцом маркеров, — окрашенных белков, например, гемоглобина.
1.2 Применение метода изоэлектрического фокусирования в фармацевтическом анализе лекарственных средств
Метод изоэлектрического фокусирования применяется в фармацевтическом анализе, биохимических анализах, в судебной медицине, в научно-исследовательских изысканиях, в сельском хозяйстве и других хозяйственных отраслях.
В фармацевтическом анализе метод изоэлектрического фокусирования используется для оценки генно-инженерных препаратов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов (содержание не менее 95 %), предназначенных для применения в качестве лекарственных средств [1].
В статье ОФС.1.7.2.0021.15 «Изоэлектрическое фокусирование» чётко обозначено, что метод включён в новое издание Государственной Фармакопеи РФ как современный метод анализа генно-инженерных препаратов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов [1].
В анализе лекарственных средств метод изоэлектрического фокусирования применяется для:
Идентификации лекарственных препаратов, при условии, что близка подвижность изоэлектрической точки исследуемого и стандартного образца или маркера. Допустимое различие подвижности испытуемого и стандартного образцов при оценке подлинности должно быть указано в частной статье.
Оценки примесей в исследуемых образцах по интенсивности окрашивания полос относительно основных компонентов по сравнению со стандартным образцом. Для количественного определения примеси должно быть предусмотрено применение контрольных образцов с концентрацией, соответствующей пределу количественного определения примеси.
Определения количественного содержания активных ингредиентов с использованием денситометра сравнением интенсивности окраски полос. Испытание проводят со стандартным образцом с известной концентрацией [11].
Испытанию подлежат субстанция и очищенный белок до добавления стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.
Методика также может использоваться для анализа готовой продукции в сравнении со стандартным образцом (стандартные образцы указываются в фармакопейной статье и нормативной документации).
Метод изоэлектрического фокусирования используется в судебно-химических исследованиях. Учёный судебно-медицинский эксперт Марк Владимирович Кисин с соавторами внедрил в судебно-химический анализ метод установления полиморфных белков с использованием изоэлектрического фокусирования [3]. Профессор 1-го Московского медицинского института им. И. М. Сеченова, автор учебника по судебной медицине для студентов ВУЗов Юрий Иванович Пиголкин разработал методику судебно-химического исследования следов крови в судебно-медицинской практике на основе метода изоэлектрического фокусирования [6].
Метод используется в медицине при диагностике онкологических, инфекционных, генных заболеваний, научно-исследовательских работах по медицинским темам. Метод изоэлектрического фокусирования был применён при создании тест-систем для проведения протеомного анализа в онкологии с целью ранней диагностики раковых заболеваний.
В Российском научно-исследовательском противочумном институте с использованием метода изоэлектрического фокусирования был создан «белковый портрет» лизатов возбудителей особо опасных инфекций. Большое значение в исследовании динамики экспрессии генов сотрудниками Института имела методика 2D-электрофореза и изоэлектрического фокусирования как этап очистки белков микроорганизмов (рис. 3) [7].
