Хроматографические методы анализа

Содержание

• Введение
• 1. Хроматографические методы анализа
• 2. Классификация хроматографических методов анализа
• 2.1 Адсорбционная хроматография
• 2.2 Распределительная хроматография: на бумаге, в тонком слое, газожидкостная и ионообменная
• 2.3 Проникающая и аффинная хроматография
• 3. Основные цели хроматографических методов анализа
• Заключение
• Список использованной литературы

Введение

Уровень промышленного развития страны характеризуется не только объемом производства и ассортиментом выпускаемой продукции, но также показателями ее качества.

Качество продукции регламентируется едиными требованиями, предъявляемыми к данному виду продукции на основе действующей нормативной и технической документации. Технические регламенты и стандарты, а также правила, нормы, рекомендации помогают осуществлению организационных, технологических, экономических и других мероприятий, направленных на повышение качества продукции.

Качество сырья и готовой продукции должно соответствовать требованиям нормативной и технической документации, где изложены все технические требования к качеству сырья, правила его приемки, методы испытания, а также условия хранения, гарантии предприятия-изготовителя. Стандартизованные методы контроля качества готовых продуктов постоянно совершенствуются, заменяются более точными и универсальными, современными. Работники лабораторий должны систематически пополнять свои знания в этой области.

В России проблемы качества и все вопросы, связанные с созданием общегосударственной системы управления качеством, сегодня приобретают чрезвычайную актуальность [3,16]. Экономическое возрождение России немыслимо без создания условий, обеспечивающих высокое качество и безопасность отечественных товаров, повышение их конкурентоспособности, защиту прав потребителей на внутреннем и мировом рынках. В связи с этим творческое усвоение теоретических и практических знаний специалистами в области изучения и использования методов анализа сырья и пищевых продуктов и проведения экспертизы качества является актуальной задачей, так как недооценка значения качества продукции и необходимости систематической и целенаправленной работы по его повышению приводит к потере позиций российской промышленности во многих ключевых отраслях. Среди эффективных средств для выполнения поставленной задачи важное место занимает экспертиза качества товаров. Цель такой экспертизы — на основе тщательного анализа качества товаров определить их потребительскую ценность, т.е. социальную эффективность, полезность, удобство пользования и эстетическое совершенство, что реализуется при использовании современных методов анализа [5]. Будучи элементом системы управления качеством товаров, экспертиза призвана стать барьером на пути к потребителю некачественных, неконкурентоспособных товаров, а также к производству и реализации опасной продукции. В современных условиях проблемы определения качества, безопасности и физиологической ценности пищевых продуктов решаются на основе глубокого исследования их состава, физико-химических и реологических свойств с использованием современных методов анализа [4,6,12,13,15].

Наиболее широко применяются следующие методы исследования: объемные методы анализа (титрование: прямое, косвенное и обратное); физические (гравиметрические (весовые); потенциометрические; кондуктометрические; рефрактометрические; колориметрические и спектрофотометрические (количественный колориметрический анализ, принцип фотометрического определения веществ, нефелометрия, флуоресценция, фотографический атомно-эмиссионный спектральный анализ, атомно-абсорбционная спектроскопия; поляриметрический и полярографический методы анализа; радиометрический; хроматографические методы анализа (адсорбционная хроматография; распределительная хроматография: на бумаге, в тонком слое, газожидкостная и ионообменная; проникающая и аффинная хроматография).

хроматография пищевой продукт проникающая

1. Хроматографические методы анализа

Хроматография основана на разделении сложных смесей на составные компоненты между двумя несмешивающимися фазами, из которых одна подвижная, а другая неподвижная.

Существенным признаком хроматографического процесса является его динамический характер. В ходе процесса происходит перемещение подвижной фазы, содержащей анализируемую пробу, через неподвижную фазу. Причем взаимодействие «сорбция-десорбция» повторяется многократно, что обусловливает высокую эффективность хроматографического разделения.

Хроматографические методы широко применяют при исследовании состава и свойств пищевых продуктов. Они позволяют проводить исследования, не выполнимые другими инструментальными методами [2,10,11,17].

Методики, основанные на использовании хроматографических методов разделения, довольно разнообразны и позволяют успешно исследовать практически любые пищевые продукты [1,7,8,14].

Благодаря высокому уровню развития экспериментальной техники и инструментального оснащения современные хроматографические методы позволяют с большой степенью точности и воспроизводимости решать сложные аналитические задачи, стоящие перед работниками лабораторий контроля качества пищевых продуктов, полуфабрикатов и сырья. В последние годы вследствие усовершенствования хроматографического метода были достигнуты высокая эффективность, значительная скорость разделения, что позволило использовать его и как микроаналитический метод [9,15].

2. Классификация хроматографических методов анализа

В основе хроматографических методов лежит широкий круг физико-химических процессов: распределение, адсорбция, ионный обмен, диффузия, комплексообразование и др.

В зависимости от природы процесса, обуславливающего механизм разделения, т.е. от типа взаимодействия между компонентами разделяемой смеси, подвижной и неподвижной фазами различают следующие основные варианты хроматографии: распределительную, адсорбционную, ионообменную и гель-фильтрационную.

Хроматографические методы также принято классифицировать в соответствии с выбранным типом подвижной и неподвижной фаз. Подвижная фаза может быть жидкой, твердой или представлять собой смесь жидкой или газообразной фаз и обычно перемещается по неподвижной фазе или пропускается через нее.

Газовая хроматография (ГХ) объединяет те методы, в которых подвижной фазой является газ; жидкостная хроматография (ЖХ) — методы, в которых подвижной фазой служит жидкость.

В зависимости от агрегатного состояния обеих фаз различают следующие виды хроматографии: твердо-жидкостную хроматографию (ТЖХ), жидкость-жидкостную (ЖЖХ), газо-адсорбционную (ГАХ), газо-жидкостную (ГЖХ).

В настоящее время преимущественное развитие получила газовая хроматография (ГХ), чему способствовало создание чувствительных и универсальных газовых хроматографов с автоматическим детектированием. Этот метод предназначен для разделения и анализа летучих (в том числе и летучих при высоких температурах) соединений. На сегодняшний день — это один из наиболее эффективных способов анализа органических компонентов. Применяется при контроле качества, сертификации продукции, технологическом контроле и экологической безопасности.

Метод ГХ хорошо поддается автоматизации, в чем его неоспоримое преимущество перед другими современными физико-химическим исследованиями. Будучи одновременно и качественным и количественным методом анализа сложных смесей различных органических и неорганических соединений, ГХ используется и для комплексного изучения пищевых продуктов.

Газовая хроматография отличается от других хроматографических методов тем, что газ используется как подвижная фаза, а растворенное вещество перемещается по колонке в виде газа или пара, частично растворенного или адсорбированного в неподвижной фазе.

Разделение компонентов смеси основано на различной адсорбируемости или растворимости анализируемых компонентов при движении их газообразной смеси вдоль поверхности твердого тела или неподвижной жидкости в колонке.

При прохождении через колонку отдельные компоненты улавливаются (адсорбируются) активным адсорбентом или растворяются в пленке неподвижной жидкой фазы, нанесенной на поверхность инертного носителя. В результате неодинаковой адсорбируемости или различного взаимодействия с жидкой фазой компоненты смеси продвигаются по колонке с различными скоростями. Движение молекул веществ, обладающих более высокой сорбируемостью в жидкой фазе, замедляется, а неадсорбируемые или нерастворимые компоненты выходят из колонки первыми.

2.1 Адсорбционная хроматография

Разделение при адсорбционной хроматографии основано на различной адсорбируемости компонентов анализируемой смеси на адсорбенте. Эти свойства в основном определяются молекулярной структурой соединений. Вещество с более высоким коэффициентом распределения передвигается по поверхности адсорбента с большей скоростью. Если соединения окрашены, то при их разделении можно видеть окрашенные полосы (рис.1).

Рис. 1. Этапы хроматографического разделения на колонке: а — поступление смеси на стартовую точку; б — опережение одного компонента другим; в — появление на выходе

Разделяемую пробу можно собрать в виде фракций пропусканием соответствующего растворителя через колонку, а затем производить анализ. Эффективность разделения во многом зависит от правильного выбора адсорбента.

Адсорбенты, применяемые в колоночной хроматографии, представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Адсорбенты в колоночной хроматографии

2.2 Распределительная хроматография: на бумаге, в тонком слое, газожидкостная и ионообменная

Распределительная хроматография осуществляется на колонках (газожидкостная и колоночная хроматография) либо на специальной хроматографической бумаге (распределительная хроматография на бумаге).

Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей (неподвижная фаза). Если бумагу поместить в слой неводного растворителя, то под воздействием капиллярных сил неводный растворитель (подвижная фаза) будет перемещаться и молекулы анализируемого вещества, предварительно нанесенного на хроматографическую бумагу, будут распределяться между фазами в соответствии с их коэффициентом распределения Rf. Каждое вещество характеризуется своей величиной Rf

В идеальном случае Rf определяется только природой вещества, параметрами бумаги и свойствами растворителей и не зависит от концентрации вещества и присутствия других компонентов.

По технике выполнения различают следующие виды хроматографии на бумаге: одномерную, двухмерную и круговую.

Первые два вида могут быть получены в восходящем и нисходящем потоке растворителей (рис.2). Однако двумерная хроматография открывает более широкие возможности в разделении сложных смесей, чем одномерная.

К хроматографической бумаге и растворителям предъявляются определенные требования: бумага должна быть однородной по плотности, химически чистой и инертной по отношению к разделяемым компонентам и подвижному растворителю; объемные соотношения растворителей приведены в таблице 2.

При использовании тонкослойной хроматографии (ТСХ) сорбент распределяют тонким слоем (0,25-5,00 мм) на стеклянные или металлические пластинки. Пробу в виде пятна наносят при помощи микропипетки на расстоянии примерно 2,5 см от нижнего края пластинки. Разделение проводят в стеклянной камере, на дно которой налит растворитель слоем 2 см. Пластинку оставляют в камере на определенное время для уравновешивания в закрытом состоянии.

Рис. 2. Восходящая (а) и нисходящая (б) хроматография на бумаге: 1 — крышка; 2 — держатель; 3 — зажим; 4 — бумага; 5 — стеклянная камера; 6 — место нанесения пробы; 7 — растворитель; 8 — стеклянная палочка; 9 — лоток с растворителем

Таблица 2 — Объемные соотношения растворителей, используемые в распределительной хроматографии

Многие специальные сорбенты для тонкослойной хроматографии содержат флуоресцирующие красители, поэтому после разделения можно просматривать пластины в ультрафиолетовом свете и при этом отдельные компоненты разделяемой смеси выявляются на них в виде окрашенных пятен.

При тонкослойной хроматографии для разделения веществ применяют ряд растворителей, приведенных в таблице 3.

Таблица 3 — Системы растворителей для тонкослойной хроматографии

Эффективность разделения можно повысить с помощью двухмерной хроматографии (рис.3).

Рис. 3. Двухмерная хроматограмма

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) основан на распределении анализируемых соединений между жидкой и газовыми фазами. Благодаря высокой чувствительности и быстроте разделения он используется для количественного и качественного анализов. Принципиальная схема газожидкостного хроматографа приведена на рис.4.

Основное преимущество данного вида хроматографии перед другими методами заключается в том, что благодаря большой скорости десорбции разделяемых компонентов в газовой среде можно значительно ускорить продвижение проявителя (газа-носителя) и тем самым ускорить процесс разделения.

Например, анализ пятикомпонентной смеси летучих углеводородов, спиртов, жирных кислот, эфиров и т.д. на газовом хроматографе с высокочувствительным детектором может быть проведен за 5 мин.

Рис. 4. Принципиальная схема газожидкостного хроматографа (а) пламенно-ионизационного детектора (б): 1 — детектор; 2 — усилитель; 3 — самописец; 4 — интегратор; 5 — место введения пробы; 6 — устройство, регулирующее температуру термостата; 7 — хроматографическая колонка; 8 — термостат; 9 — запальное устройство; 10 — выходное отверстие; 11 — пламя; 12 — электрод

По полученным хроматографическим кривым можно определить количественный состав анализируемой смеси путем измерения высоты максимумов пиков, а также найти произведение удерживаемого объема разделяемых веществ на высоту пиков.

Площадь пиков в данном случае находят с помощью планиметра, взвешиванием на аналитических весах вырезанного из бумаги пика и сравнением с массой куска той же бумаги известной площади, либо умножением половины высоты пика на его ширину. Удерживаемый объем рассчитывают по оси объемов от момента ввода порции анализируемой пробы до момента достижения максимума пика.

В стандартных условиях (температура, скорость пропускания газа-носителя и т.д.) время прохождения анализируемого соединения через колонку является постоянной величиной и называется временем удерживания. При количественном анализе в ГЖК используют внутренний стандарт — соединение, которое по физическим свойствам очень близко к исследуемому, и при хроматографировании движется вдоль колонки.

Отечественная промышленность выпускает хроматографы лабораторного и промышленного типов, обладающие чувствительностью, для некоторых типов 5•10^-14 моль/с.

В основе ионообменной хроматографии многих соединений (аминокислот, органических кислот, сахаров и т.д.) лежит способность к ионизации, обусловливающая суммарный положительный или отрицательный заряд.

Разделение веществ с помощью этого вида хроматографии проводят на колонках, заполненных ионообменной (катионо — или анионообменной) смолой. Набухшую смолу помещают в колонку (рис. 5) и подвергают регенерации, пропуская через нее раствор НС1 молярной концентрацией 1 моль/дм³ (для катионообменной) или NaOH той же концентрации (для анионообменной). Затем колонку промывают дистиллированной водой до полного удаления регенерирующего вещества, после чего она готова к хроматографированию. Этот принцип используется во всех промышленных приборах — автоматических аминокислотных анализаторах.

Для разделения ионообменной хроматографией высокомолекулярных соединений (белков, нуклеотидов и др.) в качестве фильтра широко применяется модифицированная целлюлоза.

Рис. 5. Хроматографическая колонка упрощенного (а) и усовершенствованного (б) вариантов: 1 — резервуар; 2 — элюирующий раствор; 3 — стеклянная колонка; 4 — наполнитель; 5 — стеклянная вата; 6 — осуд Мариотта с элюирующим раствором; 7 — регулирующий поршень; 8 — сетка из нейлона; 9 — капиллярный шланг, соединенный с регистрирующим устройством и (или) коллектором фракций

2.3 Проникающая и аффинная хроматография

Метод проникающей хроматографии заключается в разделении молекул по размерам при пропускании через плотное молекулярное сито.

Разделение веществ при помощи гелей, основанное на том же принципе, называется гель-фильтрацией.

В качестве молекулярного сита при проникающей хроматографии используют гели с поперечными сшивками (сефадексы) агарозные гели (сефароза, биогель-А), полиакриламидный гель (биогель-Р) и полистиролы (биобидз-S), а также пористые стеклянные шарики (биоглас) и пористый кварц (поросил). Изменяя число поперечных сшивок, удается получать несколько типов сефадексов, различающихся степенью пористости частиц, что позволяет успешно применять их для разделения веществ с различными размерами молекул.

При проникающей хроматографии также пользуются колонками. В последнее время для разделения аминокислот, углеводов, стероидов и липофильных соединений применяют тонкослойную гель-филътрацию на пластинках.

В основе метода аффинной хроматографии лежит уникальное свойство макромолекул — биологическая специфичность, что позволяет при разделении получать вещества высокой степени чистоты. Поэтому аффинная хроматография успешно применяется для очистки белков, витаминов, ферментов и других высокомолекулярных соединений.

Для разделения веществ методом аффинной хроматографии необходимо точно знать кинетические свойства исследуемых соединений, например ферментов.

При очистке всех видов макромолекул методом аффинной хроматографии наблюдается следующее:

М+Л (К+1) / (К-10) >МЛ.

Его эффективность (а, следовательно, и очистки) зависит от природы образующегося комплекса МЛ (Л — лиганд для матрицы).

Чтобы правильно выбрать лиганд для этого процесса, необходимо знать свойства подлежащих очистке макромолекул. Лиганд должен содержать химическую группу, которая не участвует в связывании лиганда с макромолекулой, но посредством которой идет его сшивание с матрицей. Чтобы в процессе сшивания не нарушалась способность к связыванию, целесообразно использовать специальные удлиняющие «мостики» (чаще всего это диамины типа NH₂ (CH2) _х-NH₂, где Х=2-6).

Колонка для аффинной хроматографии заполняется связанной с лигандом матрицей и уравновешивается буферным раствором, который используется для растворения исследуемого вещества.

Идеальная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии должна содержать большое число химических групп, способных ковалентно связываться с лигандом, не разрушаться при связывании и последующей элюации макромолекул, обеспечивать быстрое протекание растворителя. Обычно в качестве матрицы применяют агарозу, синтетические полиакриламидные гели, полистирольные смолы и пористые стеклянные шарики.

3. Основные цели хроматографических методов анализа

Хроматографические методы широко применяются для контроля качества пищевых продуктов. Можно выделить следующие основные цели хроматографических методов анализа:

— установление пищевой ценности продуктов, в частности, определение белков (состава аминокислот), жиров, сахаров, витаминов, микроэлементов;

— определение доброкачественности, свежести пищевых продуктов,

— определение стадии порчи продуктов;

— обнаружение фальсификации пищевых продуктов;

— контроль техногенных загрязнителей;

— контроль природных загрязнителей;

— определение пищевых искусственных добавок;

— контроль ароматов пищевых продуктов;

— анализ ветеринарных препаратов;

— определение трансгенных продуктов;

— контроль загрязнений от упаковок;

— контроль специальных обработок пищевых продуктов, в частности, радиацией или термообработкой.

По хроматографическим методам анализа пищевых продуктов опубликованы десятки книг и сборников, сотни обзоров. Опубликованы как книги общего характера [19, 20,21,25,26], так и специальные по анализам витаминов [22], сахаров [18], микотоксинов [24], липидов [23] и др.

Метод газовой хроматографии является эффективным для анализа органических компонентов, таких как сивушные масла, альдегиды, эфиры, метанол, растительные и животные масла, молочные жиры, пестициды, нитрозамины, консерванты, красители. Отдельная область применения газовой хроматографии — анализ состава аромата пищевых продуктов.

В последнее время для определения различных веществ (витаминов, углеводов, органических кислот, неорганических ионов, гормонов, антоцианов, канцерогенов и др.) используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод отличается более высокими аналитическими показателями, быстротой и экономичностью. ВЭЖХ применяется для контроля качества выпускаемой продукции и используемого сырья, экологического и санитарного контроля (например, при контроле содержания микотоксинов в пищевых продуктах).

Анализ пищевых продуктов с применением жидкостных хроматографов дает возможность селективного определения сахаров в сложных смесях пищевых продуктов, в частности, в растворимом кофе, фруктовых напитках и соках, цитрусовых соках, диетических сладостях и пище, меде, молоке, в сладком картофеле и других продуктах.

Жидкостные хроматографы позволяют определить селективно и с низким пределом детектирования природные полифенольные соединения на уровне 10-9.10-12 г в пиве, винах, бренди, хересе, зеленом и черном чае, в ягодах винограда, кофе. Кофеин, теофилин, теобромин определяют в чае, кофе, какао, напитках также с помощью хроматографии.

Заключение

В настоящее время предприятия пищевой промышленности поставляют на потребительский рынок широкий ассортимент продуктов питания, которые не всегда удовлетворяют современным требованиям качества, поэтому вопросам безопасности пищевых продуктов уделяется серьезное внимание [4,12,13]. В большинстве развитых стран проблема качества занимает ведущее положение в национальных доктринах безопасности [3,4,16].

Контроль качества продовольственного сырья и пищевых продуктов осуществляется различными физико-химическими методами анализа, среди которых хроматография является наиболее универсальным, так как позволяет определять летучие и нелетучие компоненты пищи, основные ингредиенты и примеси. Благодаря универсальности, чувствительности, экспрессности, доступности аппаратуры этот метод применяют для анализа исходного пищевого сырья, на всех стадиях технологического процесса и для контроля качества на выходе продукции.

Список использованной литературы

1. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. — М.: Колос, 2001 — 376 с.

2. Астахов А.В. Применение газовой хроматографии для анализа пищевых продуктов / А.В. Астахов, Е.М. Глазырин, В.А. Лапин // Пищевая промышленность. — 2007. — №3. — С.12-13.

3. Еганян А.Г. Улучшение качества продуктов питания как основа повышения конкурентоспособности / А.Г. Еганян // Пищевая промышленность. — 2006. — № 6. — С.52-53.4 Егоров, А.А. Современные методы анализа в пищевой промышленности / А.А. Егоров, С.А. Хуршудян // Пищевая промышленность. — 2002. — № 9. — С.68-69.

4. Ерохина С.И. Методы контроля токсичных элементов в пищевых продуктах / С.И. Ерохина, Л.А. Ермаченко // Пищевая промышленность. — 2002. — № 11. — С.70-72.

5. Журавская Н.К., Гутник Б.Е., Журавская Н.А. Технохимический контроль производства мяса и мясопродуктов — М.: Колос, 2001. — 476 с.

6. Коростелев П.П. Лабораторная техника химического анализа. — М.: Химия, 1981.

7. Лурье И.С., Шаров А.И. Технологический контроль сырья в кондитерском производстве. М.: Изд-во «Колос», 2001.352с.

8. Марх А.Т., Зыкина Т.Ф., Голубев В.Н. Технохимический контроль консервного производства. — М.: Агропромиздат, 1999. — 304 с.

9. Петров И.К. Технологические измерения и приборы в пищевой промышленности. — М.: Агропромиздат, 1985. — 343 с.

10. Пивоваров Ю.В. Определение состава антоцианов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Ю.В. Пивоваров, А.А. Приданцев, Е.В. Иванова, В.А. Зенин // Пищевая промышленность. — 2003. — № 9. — С.82-83.

11. Рыбакова Е.В. Высокоэффективная ионная и жидкостная хроматография для анализа продуктов питания для детей / Е.В. Рыбакова // Пищевая промышленность. — 2005. — № 3. — С.24-26.

12. Скурихин И.М. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / И.М. Скурихн, В.А. Тутельян. — М.: Браднес, Медицина, 1998. — 342 с.

13. Снегирева И.А. Современные методы исследования качества пищевых продуктов / И.А. Снегирева, Ю.Н. Жванко, Т.Г. Родина. — М., «Экономика», 1986. — 222 с.

14. Химический состав пищевых продуктов. Справочник под ред. И.М. Скурихина. — М.: Агропромиздат, 1987.

15. Хмельницкий Р.А. Современные методы исследования агрономических объектов. — М.: Высшая школа, 1981. — 256 с.

16. Хуршудян С.А. Атомно-абсорбционный анализ в системе обеспе¬чения безопасности пищевых продуктов / С.А. Хуршудян, Ю.М. Садагов // Пищевая промышленность. — 2001. — № 6. — С.72-73.

17. Яшин Я.И. Хроматографические методы для контроля качества и безопасности пищевых продуктов / Я.И. Яшин, А.Я. Яшин // Пищевая промышленность. — 2005. — №6. — С.14-15.

18. Betina Y. (Editor) Chromatographia of Mycotoxins: Techniques and Appli — cations. Elsevier, Amsterdam, 1993, 440 p.

19. Food Analysis by HPLC. Ed L. M. L. Nollet Marcel Dekker, New York, 1992, 776 p.

20. Heftmann E., Deyl Z. (Sd). Applications of Chromatography and Electrophoresis in Food Science (J. Chrom. spec. v624) Elsevier, 1992, 512 p.

21. Matter L. Food and Environmental Analysis by Capillary Gas Chromatography, Huthig, Heidelberg, 1997, 178 p.

22. Modern Chromatographic Analysis of Vitamins Ed. A. P. De Leenheer, W. E. Lambert, H. J. Nelis Marcel Dekker, 1992, 592 p.

23. Roach J. A. C. e. a. GC-MS lipids In: Hamilton R. J. and Cast J. (Editor) Spectral Prop. Lipids, Sheffield Academic Press 1999, p. 191-234.

24. Shaw P. E. CRC Handbook of Sugar Separations in Foods by HLPC CRC Press, London, 1988, 184 p.

25. Shibamoto T. Chromatographic Analysis of Environmental and Food Toxicants. Marcel Dekker, New York, 1998, 344 p.

26. Sorensen H., Sorensen S. and Bijergegaard C. Chromatography and Capillary Electrophoresis in Food Analysis, Royal Soc. Chem. Cambridge, 1999, 470 p.