Характеристики отдельных биохимических показателей эритроцитов при их хранении в присутствии глюкозы - дипломная работа готовая

ООО "Диплом777"

8:00–20:00 Ежедневно

Никольская, д. 10, оф. 118

Дипломная работа на тему Характеристики отдельных биохимических показателей эритроцитов при их хранении в присутствии глюкозы

Таврический национальный университет им.В.И. Вернадского

Специальность: биология

Дипломная работа

на соискание квалификационного уровня “специалист”:

Характеристика отдельных биохимических показателей эритроцитов при их хранении в присутствии глюкозы

Донских Е.С.

Симферополь, 2010.

Целью настоящей работы являлось изучение отдельных биохимических показателей эритроцитов в условиях их хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

Задачи работы:

1. Определить содержание общего и гликозилированного гемоглобина в эритроцитах в условиях хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

2. Определить содержание фосфоенолпирувата и АТФ в эритроцитах в условиях хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

Исследования проводились на базе кафедры биохимии Таврического национального университета им.В.И. Вернадского.

В ходе исследований было проведено 105 анализов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при хранении эритроцитов при 4єС в условиях притока глюкозы в эритроцитах усиливаются гликолитические реакции, что связанно с увеличением фосфоенолпирувата и АТФ и вместе с этим возрастает содержание гликозилированного гемоглобина, что зависит от уровня свободной глюкозы в эритроцитах.

Ключевые слова: старение эритроцитов, глюкоза, фосфоенолпируват, АТФ, гликозилированный гемоглобин.

Содержание

  • Введение
  • 1. Обзор литературы
  • 1.1 Особенности строения и дифференцировки эритроцитов
  • 1.2 Биохимические процессы при созревании и старении эритроцитов
  • 1.3 Реакция оксигенации
  • 1.4 Особенности углеводного обмена в эритроцитах. Гликозилирование гемоглобина
  • 2. Материалы и методы исследований
  • 2.1 Материал
  • 2.2 Методы исследования
  • 2.2.1 Получение гемолизата эритроцитов
  • 2.2.2 Определение концентрации гемоглобина
  • 2.2.3 Определение количественного содержания гликозилированного гемоглобина
  • 2.2.4 Количественное определение содержания в гемолизате эритроцитов глюкозы
  • 2.2.5 Количественное определение в гемолизате эритроцитов АТФ
  • 2.2.6 Количественное определение в гемолизате эритроцитов эритроци тов фосфоенолпирувата
  • 2.2.7 Статистическая обработка полученных данных
  • 2.3 Техника безопасности
  • 3. Результаты исследования и их обсуждение
  • 3.1 Количественное содержание в эритроцитах глюкозы, общего и гликозилированного гемоглобина при их хранении в условиях притока глюкозы извне (инкубация в 5мМ растворе глюкозы)
  • 3.2 Количественное содержание фосфоенолпирувата и АТФ в гемолизате эритроцитов в условиях их хранения в растворе глюкозы
  • Выводы
  • Список литературы

Введение

В последние годы становиться все более актуальным изучение эритроцитов, так как они являются наиболее многочисленной частью форменных элементов крови, представляют собой мелкие двояковогнутые диски, наполненные гемоглобином. Они играют большую роль в переносе на своей поверхности не только кислорода, но и других веществ [22].

Транспортная функция эритроцитов существенно сложнее, чем это представлялось ранее. Как показали исследования последних десятилетий, транспортная функция эритроцитов не ограничивается пределами на поверхностных мембранах. Эритроциты адсорбируют из плазмы крови глюкозу, аминокислоты, белки, липиды и переносят их к тканям [32]. Глюкоза является основным показателем углеводного обмена, т.е. первичным источником энергии в организме, а мозг и эритроциты полностью зависят от уровня глюкозы для своих потребителей. Более половины энергии, которую расходует наш организм, образуется за счет окисления. Следовательно, концентрация глюкозы в организме играет ведущую роль в энергетическом метаболизме и её поддержание на должном уровне, является существенным и определяющим для жизнеспособности. Концентрация глюкозы в крови определяется балансом между её расходованием и приходом из пищи или в результате синтеза в организме [20].

Исследование метаболических процессов в эритроцитах при различных состояниях организма является актуальным и может способствовать более глубокому пониманию тех изменений, которые претерпевают эритроциты под воздействием различных факторов [8].

Известно, что обмен глюкозы занимает важное место в структурной организации и функционировании эритроцитов в условиях хранения.

Целью настоящей работы являлось изучить отдельные биохимические показатели эритроцитов в условиях их хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

В задачи работы входило:

1. Определить содержание общего и гликозилированного гемоглобина в эритроцитах, в условиях хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

2. Определить содержание фосфоенолпирувата и АТФ в эритроцитах в условиях хранения в присутствии 5мМ раствора глюкозы.

1. Обзор литературы

1.1 Особенности строения и дифференцировки эритроцитов

Эритроциты – единственные клетки, которые имеют только клеточную мембрану и цитоплазму. Дифференцировка стволовых клеток в специализированные, происходит в клетках костного мозга и заканчивается в кровотоке. Особенности строения эритроцитов соответствуют их функциям: большая площадь поверхности обеспечивает эффективность газообмена, эластичная клеточная мембрана облегчает движение по узким капиллярам, специальная ферментативная система защищает эти клетки от активных форм кислорода. Эритроциты, так же как и другие клетки крови, образуются из полипотентных стволовых клеток костного мозга [32].

Размножение и превращение начальной клетки эритроидного ряда в унипотентную стимулирует ростовой фактор интерлейкин-3. Интерлейкин-3 синтезируется Т-лимфоцитами, а также клетками костного мозга. Это низкомолекулярный белок группы цитокинов – регуляторов роста и дифференцировки клеток [3]

Дальнейшую пролиферацию и дифференцировку унипотентной клетки эритроидного ряда регулирует синтезирующийся в почках гормон эритропоэтин. Скорость образования эритропоэтина в почках зависит от парциального давления кислорода. При недостатке кислорода скорость образования гормона повышается и соответственно количество эритроцитов тоже увеличивается. Хроническая почечная недостаточность сопровождается снижением образования эритропоэтина в почках, что приводит к развитию анемии [5].

В процессе дифференцировки на стадии эритробласта происходят интенсивный синтез гемоглобина, конденсация хроматина, уменьшение размера ядра и его удаление. Образующийся ретикулоцит ещё содержит глобиновую мРНК и активно синтезирует гемоглобин. Циркулирующие в крови ретикулоциты лишаются рибосом, ЭР, митохондрий и в течение двух суток превращаются в эритроциты. Стволовая клетка превращается в эритроцит за две недели. Эритроциты не содержат ядра и поэтому не способны к самовоспроизведению и репарации возникающих в них повреждений. Эти клетки циркулируют в крови около 120 дней и потом разрушаются макрофагами в печени, селезёнке и костном мозге.

Двояковогнутая форма эритроцитов имеет большую площадь поверхности по сравнению с клетками сферической формы такого же размера. Это облегчает газообмен между клеткой и внеклеточной средой. Кроме того такая форма, а также особенности строения мембраны и цитоскелета обеспечивают большую пластичность эритроцитов при прохождении ими мелких капилляров.

Важную роль в сохранении формы и способности к обратимой деформации эритроцитов играют липиды и белки плазматической мембраны.

Липиды бислоя плазматической мембраны эритроцитов, так же как плазматические мембраны других клеток, содержат глицерофосфолипиды, сфингофосфолипиды, гликолипиды и холестерол. Увеличение содержания холестерола в составе мембраны, которое может наблюдаться при некоторых заболеваниях, снижает её текучесть и эластичность, а следовательно и способность к обратимой деформации. Это, в свою очередь, затрудняет движение эритроцитов через капилляры и может способствовать развитию различных патологий [24].

Методом электрофореза в мембране эритроцитов обнаруживают около 15 основных мембранных белков с молекулярной массой от 15 до 250 кД. Около 60% массы мембранных белков приходится на спектрин, гликофорин и белок полосы 3 (называется так по расположению этой белковой фракции на электрофореграмме относительно других белков). Интегральный гликопротеин, гликофорин присутствует только в плазматической мембране эритроцитов. К N-концевой части белка, расположенной на наружной поверхности мембраны, присоединено около 20 олигосахаридных цепей. Олигосахариды гликофорина – антигенные детерминанты системы групп крови АВО [1].

Спектрин – периферический мембранный белок, нековалентно связанный с цитоплазматической поверхностью липидного бислоя мембраны. Он представляет собой длинную, тонкую, гибкую фибриллу и является основным белком цитоскелета эритроцитов. Спектрин состоит из б – и в-полипептидных цепей, имеющих доменное строение; б – и в-цепи димера расположены антипараллельно, перекручены друг с другом и нековалентно взаимодействуют во многих точках. Спектрин может прикрепляться к мембране и с помощью белка анкирина. Этот крупный белок соединяется с в-цепью спектрина и цитоплазматическим доменом интегрального белка мембраны – белка полосы 3. Анкирин не только фиксирует спектрин на мембране, но и уменьшает скорость диффузии белка полосы 3 в липидном слое. Таким образом, на цитоплазматической поверхности эритроцитов образуется гибкая сетевидная структура, которая обеспечивает сохранение их формы при прохождении через узкие капилляры сосудов.

Интегральный белок полосы 3 – белок-переносчик ионов С1и НСО3через плазматическую мембрану эритроцитов по механизму пассивного антипорта. Поступающий из тканей в эритроциты СО2 под действием фермента карбоангидразы превращается в слабую угольную кислоту, которая распадается на Н+ и НСО3. Образующиеся при этом протоны присоединяются к гемоглобину, уменьшая его сродство к О2, а бикарбонаты с помощью белка полосы 3 обмениваются на Clи выходят в плазму крови.

Н2О + СО2 > Н2СО3 > Н+ + НСО3> обмен на Сl.

В лёгких увеличение парциального давления кислорода и взаимодействие его с гемоглобином приводят к вытеснению протонов из гемоглобина, обмену внутриклеточного Сlна НСО3через белок полосы 3, образованию угольной кислоты и её разрушению на СО2 и Н2О [34].

Мембранный фермент Nа+, К+-АТФ-аза обеспечивает поддержание градиента концентраций Na и К по обе стороны мембраны. При снижении активности Na+, К-АТФ-азы концентрация Na в клетке повышается, так как небольшие ионы могут проходить через мембрану простой диффузией. Это приводит к увеличению осмотического давления, увеличению поступления воды в эритроцит и к его гибели, в результате разрушения клеточной мембраны – гемолизу [24].

1.2 Биохимические процессы при созревании и старении эритроцитов

Зрелый эритроцит человека является упрощенной клеткой по биохимической и структурной организации. Это высокоспециализированная безъядерная клетка. Эритроциты человека образуются из ядросодержащих клеток преимущественно в костном мозге. В этих предшественниках эритроцитов содержатся субклеточные структуры и ферментные системы, необходимые для деления, созревания, дифференцировки, процессов биосинтеза ДНК, РНК, белков, в том числе глобина, синтеза гема, липидов, углеводов, других соединений. На этой стадии развития эритроцита осуществляются окислительные процессы, тканевое дыхание, анаэробное расщепление углеводов (гликолиз), прямое окисление глюкозы через пентозофосфатный путь [2].

До сих пор нет достаточно чётких представлений о том, как соотносятся отдельные стадии созревания ядерных клеток с изменениями химического состава и обмена веществ. Однако известно, что в процессе развития клетки на стадии нормобласта уменьшается количество РНК, увеличивается содержание гемоглобина и утрачивается способность к синтезу ДНК, в связи с чем нарушается способность к митотическому делению.

Ретикулоциты – безъядерные клетки, образующиеся на последнем этапе созревания, предшествующем образованию эритроцитов, характеризуются схожей морфологией, в частности, содержат митохондрии, рибосомы, ЭПР. В ретикулоцитах осуществляется биосинтез глобина, гема, пуринов, пиридиннуклеотидов, фосфатидов, липидов [10]. РНК практически не синтезируется. Происходит фосфорилирование, сопряжённое с окислением, и гликолиз. В обмене веществ ретикулоцитов участвуют эндогенные и экзогенные субстраты, в том числе аминокислоты, глюкоза.

Последний этап созревания – превращение ретикулоцита в эритроцит протекает 1-3 дня. Происходят значительные изменения в обмене веществ и морфологии клеток.

В зрелых безъядерных эритроцитах нарушены биологический аппарат дыхания, системы синтеза белка, пуринов, порфиринов. Сохраняется способность к гликолизу, утилизации небольшого количества глюкозы в пентозном цикле и синтезу некоторых соединений, например, глутатиона.

В норме длительность жизни эритроцитов поддерживается в течение 120 дней специализированными ферментными системами. Выведение эритроцитов из циркуляции связано с изменениями (структурных компонентов, химического состава, источников энергии), характеризующими старение клеток [24]. Наиболее характерными изменениями при старении эритроцитов являются:

1) уменьшение активности различных ферментов гликолиза и пентозного цикла, что понижает интенсивность данных процессов.

2) уменьшение содержания липидов, что приводит к изменению структуры эритроцитов, увеличению чувствительности к осмотическому лизису и механическим воздействиям;

3) изменения в составе катионов в результате изменения проницаемости мембраны;

4) изменение содержания АТР, что в свою очередь связывается как с одной из причин нарушения проницаемости, так и с уменьшением длительности циркуляции эритроцитов в кровяном русле.

эритроцит гемолизат глюкоза оксигенация

Одной из ведущих гипотез старения является свободнорадикальная гипотеза, предложенная Д. Хартманом. Она связывает причины возрастных изменений с накоплением молекулярных повреждений в мембранах и генетическом аппарате клетки свободными радикалами, и продуктами перекисного окисления липидов. Нарушение нормального функционирования клетки обусловлено высокими скоростями образования высокореакционных интермедиатов кислорода (супероксидрадикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал), что в свою очередь связано с постоянно протекающими процессами оксигенации и деоксигенации гемоглобина и наличием высоких концентраций кислорода, в ходе выполнения основной функции эритроцитов – транспорта кислорода от клетки к тканям и углекислого газа в обратном направлении [31].

1.3 Реакция оксигенации

Почти весь переносимый кровью кислород связан с гемоглобином эритроцитов крови. Обратимое присоединение кислорода (оксигенация), позволяющее гемоглобину выполнять свою основную функцию переносчика, обеспечивается возможностью образовать прочные пятую и шестую координационные связи и перенести электрон на кислород не от железа (то есть окислить Fe2+), а от имидазольного кольца проксимального гистидина [14].

Эту функцию характеризует так называемая кривая оксигенации, связывающая степень насыщения гемоглобина кислородом (в%) с парциальным давлением последнего. Это заставляет предположить, что между гемами одной молекулы гемоглобина существует некоторая связь, благодаря которой присоединение кислорода к одному гему влияет на присоединение кислорода к другому гему той же молекулы. Это явление получило название гем-гем взаимодействия. Физиологический смысл гем-гем взаимодействия очевиден. Условия максимальной отдачи кислорода, при переносе гемоглобина от легких с высоким значением давления кислорода, к тканям с низким значением давления кислорода. При отсутствии гем-гем взаимодействия для одногемового миоглобина эта величина не превышает 5%. Миоглобин поэтому служит не переносчиком, а депо кислорода и отдает его мышечной ткани лишь при резкой гипоксии, когда насыщение ткани кислородом падает [18].

Первые молекулы кислорода соединяются в основном с молекулами гемоглобина еще не содержащими кислорода и гемы таким образом оксигенируются независимо. Это свидетельствуют о том, что гем-гем взаимодействие обусловлено не просто наличием нескольких гемов в молекуле, а тем, что после оксигенации одного гема меняются условия оксигенации других гемов той же молекулы. Структуры глобул оксигемоглобина и гемоглобина различны, состояния с разными значениями констант оксигенации соответствуют различным пространственным структурам белка. Для гемоглобина постулируется наличие двух таких состояний: R (от англ. relaxed) и Т (от англ. tense). Состояние R характеризуется высоким, а Т – низким сродством к кислороду (сильнее и слабее связывают молекулярный кислород соответственно). В рамках этой концепции считается, что как в R, так и в Т-состоянии сродство к кислороду субъединиц одной глобулы (т.е. есть всех четырех гемов одной глобулы) одинаково. Этот постулат позволяет построить сравнительно простую математическую модель кооперативных свойств гемоглобина: КR, КТ и L (константы равновесия реакций ассоциации в состояниях R, Т и отношение числа молекул гемоглобина в состояниях Т и R соответственно). Очевидно, увеличение константы ассоциации при переходе из состояния Т в состояние R соответствует в расчете на один гем изменению свободной энергии. Для гемоглобина человека при 37°С это “свободная энергия кооперативности”=5,61кДж/моль. Изменения электронной и пространственной структуры гемоглобина в процессе оксигенации: структура железа гема, положение атома железа относительно плоскости порфиринового кольца гема, спектральные и магнитные характеристики молекул в различных состояниях молекулы гемоглобина: дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и ферригемоглобин. В молекуле дезоксигемоглобина железо отстает от плоскости порфиринового кольца примерно на 0,5-0,6 А° (есть небольшие отличия между б и в субъединицами). Из шести 3d электронов железа Fe (II) два электрона спарены на одной из низших d-орбиталей (dxy, dyz, dxs), а четыре электрона занимают оставшиеся d-орбитали, их спиновые моменты, согласно правилу Хунда, параллельны и суммарный спин S-2. Магнитный момент гема в этом состоянии равен ~ 5,5 боровского магнетона (БМ), а спектр поглощения в зеленой области имеет характерную полосу с max ~ 556 нм. Присоединение кислорода ведет к значительным изменениям. Атом железа в оксигемоглобине лежит практически в плоскости порфиринового кольца [12]. В ферригемоглобине (метгемоглобин) при нейтральных значениях рН место кислорода занимает молекула воды, железо находится значительно ближе к плоскости гема, чем в дезоксигемоглобине, все пять d-электронов неспарены и занимают пять d-орбиталей. S = 5/2 и магнитный момент равен 5,91 БМ.

Структурные изменения в активном центре (вблизи гема) приводят и к значительным изменениям пространственной структуры всего белка [39]. Эти структурные изменения инициируются присоединением первой молекулы кислорода к одному из свободных гемов и распространяются на всю глобулу. Именно поэтому в равновесной смеси всегда присутствуют только Т – и R-формы. Эти димеры в Т-форме стягиваются 14 дополнительными (по сравнению с R-формой) солевыми мостиками (водородные связи между ионными или нейтральными группами аминоксилот, ван-дер-ваальсовы контакты). Кроме того, между б,всубъединицами в Т-форме присоединяется молекула дифосфоглицерата, что также приводит к сужению карманов. Триггером для всех описанных выше структурных перестроек при переходах между Т – и R-формами и обратно служит присоединение или отщепление кислорода. После локального элементарного химического акта: присоединение или отщепление низкомолекулярного лиганда, окисление железа при образовании ферригемоглобина (иначе говоря, после появлении лишнего положительного заряда на железе) – возникает существенно неравновесное конформационное состояние. Изменения вблизи активного центра уже произошли, а вся огромная молекула белка осталась в прежнем, еще не отрелаксировавшем состоянии. Так, например, быстрое восстановление железа в ферригемоглобине коротким (микро – или наносекунды) импульсом электронов приводит к возникновению неравновесного состояния, в котором железо уже восстановлено, но не отошло от плоскости порфиринового кольца [31]. По спектральным и магнитным характеристикам это состояние соответствует равновесному оксигемоглобину. Релаксация гема и его ближайшего окружения с удалением железа от плоскости порфиринового кольца занимает при комнатной температуре десятки микросекунд, а полная релаксация всей белковой глобулы к равновесной Т-форме дезоксигемоглобина – сотни миллисекунд.

1.4 Особенности углеводного обмена в эритроцитах. Гликозилирование гемоглобина

Для диагностики целого ряда заболеваний важно иметь объективное представление о состоянии углеводного обмена, кардинальным показателем которого служит содержание сахара в крови.

Глюкоза – основной показатель углеводного обмена, т.е. первичный источник энергии в организме, а мозг и эритроциты полностью зависят от уровня глюкозы для своих потребителей. Более половины энергии, которую расходует наш организм, образуется за счет окисления. Следовательно концентрация глюкозы в организме играет ведущую роль в энергетическом метаболизме и её поддержание на должном уровне является существенным и определяющим для жизнеспособности. Концентрация глюкозы в крови определяется балансом между её расходованием и приходом из пищи или в результате синтеза в организме. Немаловажное влияние оказывает углеводный обмен на функции эритроцита. Глюкоза проникает в эритроцит с окружающей плазмы при помощи энергозависимого переноса, на который не влияет инсулин [20].

При нормальных условиях более 90% используемой эритроцитами глюкозы подвергается гликолизу, который обеспечивает АТФ, необходимый для энергозависимых процессов через клеточную мембрану. Помимо обеспечения захвата глюкозы, эти механизмы переноса облегчают движение Na наружу и К внутрь для поддержания характерного состава содержимого в клетки против концентрационных градиентов плазмы крови. При триозофосфатдегидрогеназной реакции гликолиза также образуется НАД Н, необходимый для восстановления избытка метгемоглобина, который может образоваться в эритроците под влиянием окисляющих агентов [6].

Побочным продуктом гликолитических реакций является 2,3 дифосфоглицерат. Он является главным фосфосодержащим соединением в эритроцитах и служит важным анионом, уравновешивающим внутриклеточные катионы и действующим также в качестве буферного агента. Связываясь с гемоглобином, 2,3дифосфоглицерат уменьшает его сродство к кислороду, таким образом, облегчая освобождение кислорода в тканях.

2,3 дифосфоглицерат регулирует кислородотранспортную функцию гемоглобина, oб этом свидетельствуют данные изменения содержания этого органофосфата в крови людей, при адаптации к гипоксическим условиям. АТФ и ДФГ служат звеном, связывающим энергетику клетки с функциональной активностью содержащихся в эритроцитах молекул гемоглобина. Поэтому многие особенности поведения гемоглобина определяются особенностями гликолиза и накопления ДФГ и АТФ [9].

В эритроцитах постепенно осуществляется процесс гликозилирования гемоглобина. Гемоглобин находится в эритроците и имеет в своем составе белковый компонент – глобин, который вступает в необратимую связь с глюкозой в крови. Процесс образования такой связи называется гликозилированием, а “продукт”, который образуется, получил название гликозилированного гемоглобина. Так как количество образуемого HbA1c прямо пропорционально концентрации глюкозы в крови и длительности “соприкосновения” глюкозы и эритроцитов, данный показатель отражает состояние углеводного обмена человека за последние 90-120 дней (средняя продолжительность жизни эритроцита в организме). Процесс гликозилирования представляет собой неферментативную, посттрансляционную реакцию глюкозы с гемоглобином [10]. Подтверждением того, что присоединение глюкозы происходит после создания структурной молекулы гемоглобина и эритроцита, в целом является факт отсутствия HbA1с в эритробластах, поэтому становится понятным, почему содержание HbA1с значительно выше в старых эритрацитах. Содержание гликозилированного гемоглобина у практически здоровых людей составляет 4-6% (нормальные показатели несколько варьируются при использовании различных методов определения НbА1с). Научная значимость процесса определяется взаимосвязью между углеводным, белковым и кислородным обменами в организме человека и животных [18].

2. Материалы и методы исследований

2.1 Материал

Материалом для исследований служили эритроциты практически здоровых людей-доноров станции переливания крови г. Симферополя.

Опытные образцы эритроцитной массы инкубировали в 5мМ растворе глюкозы в течение двух недель в холодильнике при 4єС.

В исследованиях было 2 вида контроля:

1 контроль – эритроциты в исходном состоянии;

2 контроль – образцы эритромассы, инкубированные в физиологическом растворе в течении двух недель в холодильнике при 4єС.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Получение гемолизата эритроцитов

Гемолизат эритроцитов получали по методу Драбкина [36]

Принцип метода. Метод основан на разрушении мембран эритроцитов в присутствии воды и толулола и выхода содержимого эритроцитов наружу (гемолиз эритроцитов).

Ход работы. Дефибринированную кровь центрафугировали при 3000 об/мин в течении 15 минут. Плазму сливали, а эритрацитарную массу промывали физиологическим раствором (0,9% NaCl), каждый раз сливая его, путем центрифугирования в том же режиме. Промытые эритроциты гемолизировали, добавив равный объем воды и половинный объем толулола, а также интенсивно встряхивая в течении нескольких минут. Пробирки помещали в холодильник на 16 часов для полного прохождения гемолиза. После гемолиза содержимое пробирок центрифугировали при 8000 об/мин на протяжении 20 минут. Гемолизат отбирали пастеровской пипеткой.

2.2.2 Определение концентрации гемоглобина

Принцип метода. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина [12]

Ход работы. К 0,5 мл трансформирующего раствора (включает ацетонциангидрин) приливали 0,02 мл гемолизата и хорошо перемешивали, оставляли на 20мин, затем измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 при зеленом светофильтре (500-560нм) в кювете с длиной оптического пути 1см против холостой пробы (трансформирующий раствор). Стандартный раствор гемиглобинцианида измеряли в тех же условиях, что и опытные пробы.

Расчет содержания гемоглобина в г/л проводили по формуле:

С, г/л = Еоп* 150/Ест, где

Еоп – оптическая плотность опытной пробы;

Естоптическая плотность стандартной пробы;

150 – концентрация гемоглобина в стандартной пробе, г/л.

2.2.3 Определение количественного содержания гликозилированного гемоглобина

Количественное содержание гликозилированного гемоглобина определяли спектрометрическим методом [7].

Принцип метода. Метод основан на отщеплении связанной с гемоглобином глюкозы в процессе гидролиза в растворе щавелевой кислоты и на дальнейшем определении освобождающейся глюкозы по реакции с тиобарбитуровой кислотой (глюкоза образует с тиобарбитуровой кислотой окрашенный продукт, содержание которого определяется спектрофотометрически).

Ход работы. Количество гемолизата эритроцитов, в котором содержится 10 мг гемоглобина, доводили до 1 мл физиологическим раствором, добавляли 1 мл 1М щавелевой кислоты и гидролизовали в течение 5 часов при 100оС (в сильно кипящей водяной бане). После охлаждения содержимого пробирок добавляли 1 мл 40% -ного раствора ТХУ (трихлоруксусная кислота), смешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.

К 2 мл надосадочной жидкости прибавляли 0,5 мл 0,05М раствора тиобарбитуровой кислоты и инкубировали смесь в термостате при 40оС в течение 40 мин. Спектрофотометрировали пробы при длине волны 443 нм против контроля. Количество гликозилированного гемоглобина рассчитывали в процентах к общему гемоглобину, исходя из того, что экстинкция 0,029 соответствует 1% содержания гликозилированной формы белка.

2.2.4 Количественное определение содержания в гемолизате эритроцитов глюкозы

Количественное содержание глюкозы в гемолизате эритроцитов определяли глюкозооксидазным методом [21].

Принцип метода. Глюкоза в присутствии глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха до глюконовой кислоты и перекиси водорода. Последняя в присутствии пероксидазы вступает в реакцию с фенолом и 4-аминофеназоном с образованием хиномина красно – фиолетового цвета, определяемого колориметрически.

Ход работы. К 0,04 мл гемолизата эритроцитов добавляли 4 мл монореагента (фосфатный буфер с рН 7,2 – 7,4 и энзимы (пероксидаза и глюкозооксидаза) в соотношении 1:

1). Смесь выдерживали при комнатной температуре 20 мин. Параллельно ставили холостую пробу и пробу со стандартом. В холостой пробе вместо гемолизата брали физиологический раствор.

Измерение экстинкций опытной и стандартной проб производили против холостой пробы на КФК – 2 в диапазоне длин волн 500-546 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм.

Расчет содержания глюкозы осуществляли по следующей формуле:

С (ммоль/л) = Еоп.10/Ест, где

Еопэкстинкция опытной пробы;

Ест – экстинкция стандартной пробы;

10 – концентрация стандартного раствора глюкозы, ммоль/л.

2.2.5 Количественное определение в гемолизате эритроцитов АТФ

Принцип метода. В основе метода лежит то, что последний остаток фосфорной кислоты в АТФ легко отщепляется при непродолжительном гидролизе в кислой среде. Определение неорганического фосфора проводили по цветной реакции молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты [23].

Ход работы.0,5 мл гемолизата эритроцитов помещали в пробирку, стоящую на льду, добавляли в нее 5 мл охлажденного 2,5% ТХУ и перемешивали в течении 5 мин. Экстракт фильтровали в мерную пробирку, стоящую в ледяной бане. Остаток гемолизата заливали 5 мл дистиллированной воды и продолжали экстракцию 5 мин на холоде. Полученный экстракт фильтровали в ту же пробирку и доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой. В две пробирки отбирали по 0,5 мл безбелкового фильтрата. В опытную пробирку добавляли 1 мл 1М НСI, закрывали пробкой и помещали в кипящую водяную баню на 10 мин для гидролиза связей. Затем раствор охлаждали и добавляли 1 мл 1М NaOH. В контрольную пробирку без кипячения добавляли 1 мл 1М NaOH и 1 мл 1М HCI. В опытную и контрольную пробирки добавляли по 7,5 мл дистиллированной воды. Для расчета использовали стандартный раствор K2HPO4.3H2O с концентрацией Фн 0,01 мг/мл.

Из опытной, контрольной и стандартной проб отбирали по 5 мл жидкости, переносили в другие пробирки и добавляли в каждую из них по 0,5 мл 1% раствора молибдата аммония в 0,025М Н2SO4, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и по 2 мл дистиллированной воды. Смесь в каждой пробирке быстро перемешивали и оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Пробы колориметрировали на ФЕКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) против воды.

Содержание АТФ рассчитывали в мг%Фн по формуле:

С (мг%Фн) = (ЕопЕк).0,05.100/0,5. Ест, где

Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ек – экстинкция контрольной пробы;

Ест – экстинкция стандартной пробы;

0,05 – количество мгФн в 5 мл стандартного раствора;

0,5 – объем гемолизата (мл);

100 – приведение к процентному содержанию.

2.2.6 Количественное определение в гемолизате эритроцитов эритроци тов фосфоенолпирувата

Принцип метода. Фосфоенолпируват (ФЕП) в щелочной среде окисляется йодом с отщеплением неорганического фосфата, по количеству которого рассчитывается содержание ФЕП. Определение Фн проводили колориметрически по цветной реакции с молибдатом аммония.

Ход работы.0,5 мл гемолизата эритроцитов помещали в пробирку с 5мл 2,5% раствора ТХУ и экстрагировали на льду в течении 10 мин, хорошо перемешивая. Прибавляли 5мл дистиллированной воды. Полученную смесь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин.

В опытную пробу последовательно переливали 2мл центрифугата, 1 мл 2М раствора NaOH и 1мл 0,1 Н раствора IІ. Перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. При 3000об/мин. Затем в пробирку приливали по каплям 1,5 мл 2М НCl. Избыток йода оттитровывали раствором 0,05М Na2S2O4 до исчезновения бурой окраска. Общий объем доводили до 10 мл дистиллированной водой и перемешивали. Контрольная проба нужна для того, чтобы учесть наличие свободного неорганического фосфата. Для расчета концентрации неорганического фосфора готовили стандартный раствор K HPO 3H O c концентрацией 0,01 мг/мл. Из опытной, контрольной и стандартной проб отбирали по 2 мл раствора, переносили в другие пробирки, добавляли в каждую из них по 0,5мл 1% раствора молибдата аммония и 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Общий объем в каждой пробе доводили до 10мл дистиллированной водой. Пробы оставляли при комнатной температуре на 10 мин, после этого колориметрировали на ФЕКе с красным светофильтром (длина волны 670нм) в кювете с толщиной слоя 1см против дистиллированной воды. Расчет содержания ФЕП в мг%Фн осуществляли по формуле:

С (мг%Фн) = (Еоп-Ек) 0,02 Ч100/ЕстЧ0,5, где

Еоп – экстинкция опытной пробы

Ек – экстинкция контрольной пробы

Ест – экстинкция стандартной пробы (среднее из трех проб)

0,02 – количество мгФн в 2мл стандартного раствора;

0,5 – объем гемолизата (мл)

100 – приведение к проценту содержанию

2.2.7 Статистическая обработка полученных данных

Все данные были получены в 7-ти повторностях, их обрабатывали статистическим методом малых выборок [11].

При расчетах пользовались средним арифметическим М, вычисляли квадратическое отклонение у и среднюю ошибку m по следующим формулам:

M = ?xi/n, где

М – среднее арифметическое;

?xi – сумма конкретных полученных данных по соответствующему показателю;

n – количество полученных данных.

у = ; m = ±у/, где

(x-M) – отклонение каждого члена вариационного ряда от среднего арифметического.

Коэффициент Стьюдента (t) рассчитывали по формуле:

С помощью коэффициент t по таблице Стьюдента определяли достоверность различий (p), между сравниваемым средними арифметическими, за достоверные принимали различия при p?0,05.

2.3 Техника безопасности

В экспериментальной части настоящей работы были соблюдены следующие правила техники безопасности.

При работе с микроколориметром (МКФ-I), спектрофотометром (СФ-4), иономером (ЭВ-74), фотоэлектроколориметром, настольной центрифугой, сушильным шкафом, электроплиткой, источником питания была проверена техническая исправность приборов и их заземление. Все работы с концентрированными кислотами и щелочами проводились в вытяжном шкафу, при работающей вентиляции, выключенных электроприборах.

При работе с пипетками использовались груши для предотвращения попадания вредных и отравляющих веществ в организм.

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Количественное содержание в эритроцитах глюкозы, общего и гликозилированного гемоглобина при их хранении в условиях притока глюкозы извне (инкубация в 5мМ растворе глюкозы)

Из литературы известно, что спонтанное гликозилирование гемоглобина зависит от уровня в эритроцитах свободной глюкозы [18]. Поддержание данной формы гемоглобина на определенном уровне очень важно, поскольку гликозилированный гемоглобин проявляет в 10 раз более высокое сродство к кислороду. Изменение процентного кислородтранспортную функцию данного белка, а, следовательно, и метаболические процессы в тканях организма [19].

Глюкоза является основным показателем углеводного обмена, т.е. первичным источником энергии в организме, а мозг и эритроциты полностью зависят от уровня глюкозы для своих потребителей. Концентрация глюкозы в крови определяется балансом между её расходованием и приходом из пищи или в результате синтеза в организме. Метаболизм глюкозы в эритроцитах является важным звеном, обеспечивающим поддержание оптимального функционирования системы защиты клетки от разрушительного действия активных форм кислорода [20].

При изучении содержания глюкозы, общего и гликозилированного гемоглобина были полученные данные, которые представлены в таблице 3.1.

Как видно из этих данных, характер изменения количественного содержания гликозилированного гемоглобина в целом соответствует изменению уровня содержания глюкозы, что свидетельствует о зависимости спонтанного гликозилирования гемоглобина от концентрации глюкозы в эритроцитах [19].

Таблица 3.1

Содержание глюкозы, общего и гликозилированного гемоглобина в эритроцитах в условиях их хранения в 5мМ растворе глюкозы (М±m)

Объект исследования

Глюкоза,

моль/л

Общий гемоглобин, г/л

Гликозилированный гемоглобин,%

Контроль I (эритроциты в исходном состоянии)

4,55±0,05

153±4,0

2,82±0,09

Эритроциты в условиях хранения при 4єС в течение 2х недель (контроль II)

4,33±0,02*

148±2,5

2,39±0,11*

Эритроциты в условиях хранения при 4єС в течение 2х недель в 5мМ глюкозе

5,44±0,04*,**

150±3,5

3,67±0,21*,**

Примечание к таблице: * – достоверность различий по сравнению с контролем I (p<0,05), **-достоверность различий по сравнению с контролем II (p<0,05)

Из данных таблицы 3.1 видно, что снижение уровня глюкозы при двухнедельном хранении эритроцитов при 4єС уменьшалось на 4,8%, содержание гликозилированного гемоглобина – на 15% по сравнению с контролем I. Из этих данных следует, что при длительном хранении истощаются запасы глюкозы, поскольку в этих условиях продолжается использование глюкозы в гликолитических реакциях и реакциях пентозофосфатного пути. (рис 3.1).

При хранении эритроцитов в присутствии притока глюкозы извне, содержание глюкозы в гемолизате эритроцитов возрастало на 20% по сравнению с контролем I и на 25,6% по сравнению с контролем II. Содержание гликозилированного гемоглобина по сравнению с контролем I возросло на 23% и на 35% по сравнению с контролем II (рис 3.2).

Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях притока глюкозы извне в изолированных эритроцитах интенсифицируется спонтанное гликозилирование гемоглобина, в связи с ростом уровня свободной глюкозы [17].

глюкоза, ммоль/л

Рис.3.1 Содержание глюкозы в эритроцитах в условиях их хранения в 5 Мм растворе глюкозы

Концентрация общего гемоглобина в условиях их хранения, как при инкубации эритроцитов в физиологическом растворе, так и при инкубации эритроцитов в 5Мм растворе глюкозы не изменялась.

Таблица 3.2

гликозилированный гемоглобин, %

Рис.3.2 Содержание гликозилированного гемоглобина в эритроцитах в условях их хранения в 5Мм растворе глюкозы

3.2 Количественное содержание фосфоенолпирувата и АТФ в гемолизате эритроцитов в условиях их хранения в растворе глюкозы

В живом организме при нормальных условиях около 90% используемой эритроцитами глюкозы подвергается процессу гликолиза. Энергия, которая выделяется при окислении глюкозы до лактата, необходима для активного транспорта веществ через мембрану, поддержания целостности эритрацитарной мембраны, цитоскелета. Гликолитический процесс в эритроцитах сопровождается образованием 2,3-дифосфоглицерата, регулирующего сродство гемоглобина к кислороду [4].

Учитывая это обстоятельство, представлялось целесообразным изучение интенсивности гликолитических реакций в эритроцитах в условиях их хранения в растворе глюкозы. Интенсивность гликолитических реакций оценивалась по уровню фосфоенолпирувата и АТФ в эритроцитах.

В таблице 3.2 представлены полученные данные.

Таблица 3.2

Содержание АТФ и ФЕП в эритроцитах в условиях их хранения в растворе глюкозы (М±m)

Объект исследования

ФЕП, мг%Фн

АТФ, мг%Фн

Контроль I (эритроциты в исходном состоянии)

2,50±0,07

1,30±0,1

Эритроциты в условиях хранения при 4єС в течении 2х недель (контроль II)

1,60±0,08*

0,80±0,04*

Эритроциты в условиях хранения при 4єС в течении 2х недель в 5мМ глюкозе

2,40±0,04*?**

1,40±0,08**

Примечание к таблице: * – достоверность различий по сравнению с контролем I (p<0,05), **-достоверность различий по сравнению с контролем II (p<0,05).

Из полученных данных видно, что в условиях хранения эритроцитов снижение уровня глюкозы сочетается с уменьшением содержания АТФ и фосфоенолпирувата (рис 3.3). При двухнедельном хранении эритроцитов при 4єС в условиях отсутствия притока глюкозы извне, содержание ФЕП уменьшалось на 30%, содержание АТФ – на 38% по сравнению с контролем I. Уменьшение уровня ФЕП и АТФ свидетельствует о снижении интенсивности гликолитических реакций в эритроцитах, а также о более интенсивном использовании макроэргических субстратов для покрытия потребностей в энергии. Причиной снижения интенсивности гликолиза в эритроцитах может быть не только уменьшение содержания глюкозы, но также угнетение активности гликолитических ферментов [13].

ФЕПмгФн/л

Рис.3.3 Содержание фосфоенолпирувата в эритроцитах в условиях их хранения в 5Мм растворе глюкозы

При хранении эритроцитов в течение двух недель в присутствии 5Мм раствора глюкозы содержание ФЕП в эритроцитах было на 4% ниже по сравнению с контролем I, но на 33% больше по сравнению с контролем II.

Содержание АТФ в эритроцитах при хранении в присутствии 5Мм раствора глюкозы увеличилось на 43% по сравнению с контролем II (рис 3.4).

Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях притока глюкозы из – вне в изолированных эритроцитах усиливаются гликолитические реакции, направленные на обеспечение эритроцитов энергией и поддержание их структурного и функционального состояния [15].

АТФ, мг Фн/л

Рис.3.4 Содержание АТФ в эритроцитах в условиях их хранения в растворе глюкозы

На этом основании можно подвести итог, что глюкоза является одним из основных компонентов в жизнедеятельности эритроцитов. В условиях длительного хранения в эритроцитах происходит процесс их старения, но в условиях притока глюкозы извне процесс старения замедляется, метаболические процессы протекают более активней, наблюдается стабилизация исходного состояния эритроцитов. Это позволяет использовать эритроциты человека в клинической практике в условиях их длительного хранения.

Выводы

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать следующие выводы:

1. При хранении эритроцитов в условиях притока глюкозы извне наблюдается повышение уровня глюкозы и стабилизация их исходного состояния. Рост уровня глюкозы сочетается с увеличением содержания или козилированного гемоглобина в эритроцитах.

2. Концентрация общего гемоглобина как при инкубации эритроцитов в физиологическом растворе, так и при инкубации в 5мМ растворе глюкозы не изменялась.

3. Установлено, что при хранении эритроцитов в отсутствии притока глюкозы извне снижается интенсивность гликолитических реакций, о чем свидетельствует снижение уровня фосфоенолпирувата и АТФ.

4. При хранении в условиях притока глюкозы извне в изолированных эритроцитах усиливается интенсивность гликолитических реакций, что должно способствовать генерированию АТФ и поддержанию структурного и функционального состояния эритроцитов.

Список литературы

1. Асатиани В.С. Ферментные методы анализа. – М.: Наука, 1969. – С.26-40.

2. Ашкинази И.Я. Разрушение эритроцитов // Физиология системы крови. Физиология эритропоэза. – Л.: Наука, 1979. – С.274-334.

3. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии. – М.: Мир, 1987. – С.120.

4. Владимиров Г.Е. Об энергетической функции АТФ в клетке. – Л.: Наука, 1980. – 44с.

5. Гаврилов О.К., Козинец Т.И., Черняк Н.В. Клетки костного мозга и периферической крови. – М.: Медицина, 1985. – 288с.

6. Галенок В.А., Боднар П.Н., Гликозилированные протеины. Новосибирск.: Наука, 1989,-С.157.

7. Данилова Л.А., Лопатина Н.И. Колориметрический метод определения гликозилированных гемоглобинов // Лабораторное дело. – 1986.281-283с.

8. Дегли С., Никольсон Д. Метаболические пути. – М.: Мир, 1973. – С.189-196.

9. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства. – М.: Наука, 1978. – С.235.

10. Канунго М. Биохимия старения. – М.: Медицина, 1982. – 194с.

11. Клиническая биохимия. /Под ред.В. А Ткачука. – 2е изд., и доп. – М.: Медецина, 2004. – 512с.

12. Косяков К.С. Клиническая биохимия. – Л.: Медицина, 1997. – С.113-118.

13. Казеннов А.М., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз // Цитология. – 1991. – т.33, №11. – С.32-41.

14. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шагабодов А.Д. Роль белков мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов // Докл. АН СССР – 1990. – т.312. – №1. – С.223-226.

15. Кон Р.М. Ранняя диагностика болезней обмена веществ. – М.: Медицина, 1986. – С.17-42.

16. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. – Минск: Беларусь. – 1976. – 311с.

17. Коношенко С.В., Плотникова Е.В. Роль глюкозы в биохимических изменениях эритроцитов // Эксперим. клиническая физиология и биохимия. – 2008. – №2 – С.65-68.

18. Коржуев П.А. Гемоглобин. Сравнительная физиология и биохимия. – М.: Наука, 1964. С.21-24.

19. Кудрявцева С.В., Мазовецкий А.Г. Гликозилированный гемоглобин при нарушении толерантности к глюкозе. // Сов. Мед. – 1987. – №6. – С.22-24.

20. Мак – Мюррей У. Обмен веществ у человека. – М.: Мир, 1980. – С.346.

21. Масленников В.Д. Определение глюкозы в гемолизате эритроцитов // Лабораторное дело. – 1970, №15. – С.595.

22. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэл В. Биохимия человека. – М., 1993. – Т.2. – С.354-356.

23. Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия // Пер. с англ. – М. – СПб.: “Издательство БИНОМ”, 2000. – 368с.

24. Мосягина Е.Н., Фёдоров Н.А., Гудим В.И. Эритропоэз // Нормальное кроветворение и его регуляция /Под ред. Н.А. Фёдорова. – М.: Медицина, 1976. – С.341-457.

25. Мережинский М.Ф. Нарушения углеводного обмена при заболеваниях человека. – Минск.: Медицина, 1987. – С.22-28.

26. Новое в гематологии / Под ред. А.И. Воробьёва, Ю.И. Лория. – М.: Медицина, 1974. – С.18-22.

27. Патологическая биохимия / Под ред. А.Ф. Симёнова. – М.: Медицина, 1994. – С.130-147.

28. Рубина Х.М. Биохимия эритроцитов // Физиология системы крови. Физиология эритопоэза. – Л.: Наука, 1978. – С.211-232.

29. Рубина Х.М. Некоторые данные о связи метаболизма эритроцитов с их кислородно-транспортной функцией // Проблемы гематологии и переливания крови. – 1973. – №8. – 35с.

30. Солодилова М.А. Роль генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека/ Дис. на соискание ученой степени к. б. н. – М., 1999. – 160с.

31. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. – М.: Мир, 1981. – С.256-259.

32. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. – Минск: Наука и техника, 1981. – С.23-56.

33. Черняк Н.Б. Биохимические процессы при созревании и старении эритроцитов // Нормальное кроветворение и его регуляция. – М.: Медицина, 1976. – С.159-186.

34. Шандала А.М., Захаров С.Ф., Громов П.С., Шишкин С.С. Белковый состав мембран эритроцитов человека, фракционных в ступенчатом градиенте декстрана // Гематология и трансфузиология. – 1987. – №10. – С.28-31.

35. Baker W.I. Urate and ascorbate: their possible roles as antioxidants in determining longevity of mammalian species // Arch. Biochem. and Biophis. – 1987. – №2. – Р.451-457.

36. Drabkin D. A simplified technique for large scole crystallization of myoglobin and haemoglobin in the crystalline/ D. Drabkin // Archives of Biochemistry. – 1949. V.21 – P.224-226.

Поделиться работой
Поделиться в telegram
Поделиться в whatsapp
Поделиться в vk
Поделиться в facebook
Поделиться в twitter
Ирина Казакова
Ирина Казакова
Меня зовут Ирина, мне 38 лет, я закончила НТГСПИ, факультет естествознания, математики и информатики. На данный момент работаю в колледже, преподаю студентам биологию и естествознание. В свободное от работы время я помогаю студентам на сайте «Диплом777» в написании контрольных и курсовых работ. очень люблю свою работу за возможность обучать, учиться самой и делиться своими знаниями со студентами в любое время (благодаря вашей компании).

Статьи по дипломным